大蒜素对人宫颈癌HeLa细胞周期和凋亡的影响

刘玲，聂丹，邹倩，詹平，任黔川，陈建琼，毛熙光(泸州医学院附属医院，四川泸州646000)

大蒜素对人宫颈癌HeLa细胞周期和凋亡的影响

刘玲，聂丹，邹倩，詹平，任黔川，陈建琼，毛熙光(泸州医学院附属医院，四川泸州646000)

摘要:目的探讨大蒜素对人宫颈癌HeLa细胞周期和凋亡的影响。方法将2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL大蒜素分别作用于体外培养的HeLa细胞，24、48、72 h后，于倒置相差显微镜下观察HeLa细胞形态学变化;采用WST-8法测定HeLa细胞的增殖抑制率;流式细胞术测定HeLa细胞的凋亡率和细胞周期。结果倒置相差显微镜下观察到细胞凋亡的形态学改变。大蒜素干预后HeLa细胞增殖受抑，且呈浓度与时间依赖性(P均＜0.05);随着大蒜素浓度的增加，细胞凋亡率增加，G1期细胞比例增加。结论大蒜素能阻滞HeLa细胞的周期进展，诱导细胞凋亡。

关键词:宫颈肿瘤;大蒜素; HeLa细胞;细胞周期;细胞凋亡

Influence of Allicin on cell cycle and apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells

LIU Ling，NIEdan，ZOU Qian，ZHAN Ping，REN Qian-chuan，CHEN Jian-qiong，MAO Xi-guang(The Affiliated Hospital of Luzhoumedical College，Sichuan 646000，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of allicin on the cell cycle progression and apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells.Methods The HeLa cells cultured in vitro were treated withdifferent concentrations of allicin(2.5，5，10，20，40，80 and 120 μg/mL)for 24 h，48 h and 72 h.Then，themorphologic changes were observed by inverted phase contrastmicroscope.WST-8 was used tomeasure the proliferative inhibition rate of allicin on HeLa cells，and the cell cycle progression and apoptosis rate weredetected by flow cytometry.ResultsThemorphological changes of apoptosis was observed by inverted phase contrastmicroscope.The proliferation of HeLa cells was inhibited after the intervention of Allicin，which was in adose-and time-dependentmanner(all P＜0.05).With the increasing concentration of allicin，the apoptosis rate was increased and the proportion of G0/G1cells was increased significantly.ConclusionAllicin can inhibit the HeLa cell proliferation，whichmay be related to the inducing cell apoptosis and blocking cell cycle progression.

Key words:cervical carcinoma; allicin; HeLa cells; cell cycle; apoptosis

大蒜素是从大蒜的球形鳞茎中提取的挥发性油

状物具有抗菌、抗病毒、抗真菌及原虫、抗氧化、抗肿瘤、抗血小板聚集、降压、降低胆固醇、提高机体免疫等多种生物学功能［1］。大蒜中含有广泛的多硫化物，可在细胞内分解产生烯丙基硫醇和烯丙甲基硫化物，修饰含巯基的酶类，从而发挥大蒜素的各种治疗作用，能解毒致癌物质，抑制活性氧的产生，调节细胞周期和诱导细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有化学预防剂的作用［2，3］。2013年1月，我们以人宫颈癌HeLa细胞系为研究对象，用大蒜素对其进行体外干预，探讨大蒜素对细胞周期和细胞凋亡的影响。

1　材料与方法

1.1材料大蒜素(纯度95%)购自南京泽朗医药科技有限公司，以DMEM F-12培养基配制大蒜素工作液，浓度分别为2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL。细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，CCK-8试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所。人宫颈癌HeLa细胞株购自重庆医科大学病理生理学教研室(培养体系为DMEM F-12培养液，10%胎牛血清，37℃、5% CO2条件下培养，每天

换液1次，每2～3d传代1次。取对数生长期细胞用于本实验)。

1.2细胞增殖抑制率测算接种对数生长期HeLa细胞至96孔培养板，每孔加入100 μL(约5×103个细胞)，培养24 h后，加入各浓度组大蒜素，阴性对照组不加药物，空白对照组为完全培养基，每组设3个复孔，培养24、48、72 h后，分别在各时间段结束前1 h每孔加入CCK-8原液10 μL，继续培养1 h后上酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD值)，计算细胞增殖抑制率。重复实验3次。细胞增殖抑制率(%)=(1－实验组OD均值/对照组OD均值)× 100%。终止培养前，倒置相差显微镜下观察各组HeLa细胞的形态学变化。

1.3细胞凋亡率测算接种对数生长期HeLa细胞至6孔培养板，每孔加入2mL(约1×107个细胞)，培养24 h后，加入各浓度大蒜素，并按WST-8法设阴性对照及空白对照各1孔，继续培养24 h。另一6孔板加入含10 μg/mL大蒜素的培养液，共3孔，分别继续培养24、48、72 h。如前法设阴性对照及空白对照各1孔。然后用0.25%胰酶消化细胞，2 000 r/min离心5min，PBS漂洗，加入5 μL Annexin V-FTTC混匀，加入5 μL Propidium Lodide混匀;室温、避光反应5～15min，1 h内以标准程序用流式细胞仪检测，Annexin V-FITC(+)/PI(－)细胞判定为凋亡细胞。实验重复3次。

1.4细胞周期测算细胞的准备同1.3。将制备的单细胞悬液室温离心，以2% PBS液0.5mL重悬细胞，于冰上操作，100%乙醇1.5mL固定，4℃保存过夜。1 000 r/min离心5min，2% PBS液3mL洗涤，100 μL RNase A 37℃水浴30min，400 μL的PI染色混匀，4℃避光30min。上流式细胞仪检测，记录激发波长488 nm处红色荧光。使用CellQuest软件分析数据。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量数据以珋x±s表示，进行单因素方差分析和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大蒜素对人宫颈癌HeLa细胞增殖的影响随着大蒜素浓度和时间的增加，细胞增殖抑制率逐渐升高，呈浓度和时间依赖性(P均＜0.05)。见表1。

表1　不同浓度大蒜素干预人宫颈癌HeLa细胞后不同时点细胞增殖抑制率(%，)

表1　不同浓度大蒜素干预人宫颈癌HeLa细胞后不同时点细胞增殖抑制率(%，)

注:相同时点不同浓度组间两两比较，P＜0.05;相同浓度不同时点两两比较，P＜0.05。

细胞大蒜素浓度(μg/mL)细胞增殖抑制率24 h　48 h　72 h 2.5　24.42±2.67　28.45±3.32　42.19±2.76 5 26.32±1.74　31.48±1.59　55.34±1.34 10　33.27±1.33　36.67±1.58　57.32±1.80 20　36.17±0.98　41.33±1.40　59.27±1.09 40　38.40±0.96　46.39±1.10　67.11±0.86 80　43.42±1.28　67.45±1.07　73.31±1.06 120　49.44±1.25　70.36±0.68　82.37±1.02

2.2大蒜素对HeLa细胞凋亡的影响随着大蒜素浓度和时间增加，HeLa细胞凋亡率逐渐升高，呈明显浓度时间依赖性(P均＜0.05)，见表2、表3。

2.3大蒜素对HeLa细胞周期的影响不同浓度大蒜素(分别为2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL)作用HeLa细胞24 h后，低于10 μg/mL大蒜素对He-La细胞周期阻滞作用不明显;当大蒜素浓度≥10 μg/mL时，随着大蒜素浓度的增加，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低，差异有统计学意义(P＜0.05);而G2/M期的细胞数目变化不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。10 μg/mL大蒜素分别干预HeLa细胞24、48、72 h，随着作用时间的延长，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少，差异有统计学意义(P＜0.05); G2/M期细胞比例变化不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表2　不同浓度大蒜素干预24 h对HeLa细胞凋亡及细胞周期的影响(%，)

表2　不同浓度大蒜素干预24 h对HeLa细胞凋亡及细胞周期的影响(%，)

注:与0mg/mL比较，ΔP＜0.05。

大蒜素浓度(μg/mL)　　细胞凋亡率　各期细胞比例G0/G1期　G2/M期　S期0 3.29±0.38　34.20±1.21　21.79±0.85　44.01±1.53 2.5　7.02±0.12Δ　29.30±1.34　28.10±0.47　42.60±1.24 5 10.82±0.34Δ32.60±2.13　25.90±1.25　41.50±1.58 10　14.48±0.28Δ　38.10±1.62Δ8.80±1.05　53.10±1.02Δ20　18.21±0.24Δ　49.20±1.07Δ8.60±1.08　42.20±1.42Δ40　21.97±1.17Δ　56.10±1.62Δ　5.00±0.72　38.90±1.15Δ80　27.95±2.31Δ　59.80±1.20Δ　9.60±1.12　30.60±1.36Δ120　63.06±5.32Δ　66.60±3.25Δ　8.60±1.04　24.80±1.19Δ

表3　10 μg/mL大蒜素干预不同时间对HeLa细胞凋亡及细胞周期的影响(%，)

表3　10 μg/mL大蒜素干预不同时间对HeLa细胞凋亡及细胞周期的影响(%，)

注:不同时间点细胞凋亡率及G0/G1期、S期细胞比例比较，P ＜0.05。

作用时间　　细胞凋亡率　各期细胞比例G0/G1期　G2/M期　S期24 h　9.37±1.39　38.10±1.62　8.80±1.05　53.10±1.02 48 h　45.43±4.37　40.40±2.37　18.20±3.26　41.40±2.64 72 h　61.84±3.74　47.20±4.24　17.60±2.83　35.20±2.35

2.4细胞形态学改变不同浓度大蒜素干预后，HeLa细胞均明显皱缩，体积缩小，细胞大小较均等，密度降低，间隙增大，细胞漂浮，胞质及核浓缩，细胞内颗粒逐渐增多，颜色加深。随大蒜素作用浓度增

加及时间延长细胞形态改变逐渐明显。10 μg/mL大蒜素干预HeLa细胞2 h后，细胞形态即有明显凋亡表现。而对照组细胞均贴壁生长，状态良好，细胞伸展，呈梭形或不规则多角形，细胞核较大。

3　讨论

大蒜素主要依赖烯丙基和含硫基团在细胞内分解为二硫及三硫化合物，修饰含巯基的酶类，从而抑制肿瘤细胞的恶性增殖［4，5］。张敏等［6］发现大蒜素对人宫颈癌HeLa和Caski细胞有明显增殖抑制作用，大蒜素对Caski细胞作用更敏感。本实验结果显示，大蒜素呈剂量和时间依赖方式抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖，与其他癌细胞系报道一致［6］。本实验以2.5 μg/mL大蒜素作用HeLa细胞24 h，细胞增殖抑制率即为24%，说明小剂量大蒜素短时间内即可部分抑制HeLa细胞的增殖。此外，本研究还观察到大蒜素作用后的HeLa细胞体积缩小，多数细胞形态由多角形变成卵圆形或圆形，胞核变小，大蒜素可能通过控制细胞体积来调节细胞增殖。

细胞凋亡常参与多种疾病的发生与发展，尤其与肿瘤密切相关。研究认为，如果可以人为地启动肿瘤细胞凋亡系统则能达到临床治疗目的。张敏等［7］研究发现大蒜素通过上调死亡受体4、5的表达、提高caspase-3、8的活性以增强TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制人卵巢癌细胞SKOV-3的增殖。李民华等［8］研究显示，大蒜素通过上调TRAIL表达，进而活化caspase-3、8、9诱导细胞凋亡，从而实现对宫颈癌HeLa和Caski细胞生长的抑制作用。Oommen等［9］研究发现，大蒜素能激活caspase-3、8、9家族，从而促进人宫颈癌HeLa、Siha细胞(宫颈鳞癌细胞)、人大肠癌Sw480细胞凋亡。Xiao等［10］发现，大蒜素可激活NIH 3T3细胞caspase-3诱导其凋亡。本研究发现，大蒜素能促进HeLa细胞的凋亡，随着大蒜素浓度的增加，作用时间的延长，HeLa细胞的凋亡率逐渐升高。2.5 μg/mL大蒜素即可致(8.54±1.53)%的HeLa细胞凋亡，明显高于对照组的凋亡率(3.76±2.03)%，表明大蒜素对HeLa细胞的凋亡有较强促进作用。因此，本研究认为大蒜素可能通过激活某些信号传导途径，促进宫颈癌细胞凋亡，达到抑制癌细胞无限增殖的目的。

细胞在增殖、分化和凋亡方面的异常均参与了肿瘤的发生和发展，其中细胞周期紊乱是肿瘤发生机制之一。细胞周期由G1期、S期、G2期和M期构成。王霞等［11］研究证实，大蒜素可将黑色素瘤B16细胞阻滞于G0/G1期。张敏等［12］研究证实大蒜素可使人宫颈癌Hela细胞周期阻滞于G2/M期。本研究发现，大蒜素以浓度和时间依赖的方式使宫颈癌HeLa细胞G1期细胞所占比例升高，S期细胞所占比例下降，而对G2/M期细胞无影响，表明大蒜素可通过某些方式抑制细胞周期G0/G1期到S期的转换，阻滞细胞周期的进展，抑制细胞增殖。

大蒜素对胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃腺癌、白血病等多种肿瘤细胞均有明显抑制作用［12］，与化疗药物合用，能增强抗肿瘤药物的杀伤作用，并在一定程度减轻化疗不良反应［13］。本研究发现大蒜素可阻滞细胞周期的进展，诱导细胞凋亡，抑制人宫颈癌细胞的增殖。

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收稿日期:( 2015-01-18)

通信作者简介:毛熙光(1965-)，男，教授，硕士，主要研究方向为妇科肿瘤。E-mail:mxg6639@163.com

作者简介:第一刘玲(1981-)，女，主治医师，硕士，主要研究方向为妇科肿瘤、生殖内分泌。E-mail: Eye99@163.com

基金项目:泸州市科技计划项目(2011-S-36);四川省科技厅项目(2008JY0014-1)。

文章编号:1002-266X(2015)33-0015-03

文献标志码:A

中图分类号:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.005