卵巢癌组织中miRNA-204表达变化及其对细胞株SKOV3凋亡的影响

张伟熙，李家福，周春(武汉大学中南医院，武汉430071)

卵巢癌组织中miRNA-204表达变化及其对细胞株SKOV3凋亡的影响

张伟熙，李家福，周春
(武汉大学中南医院，武汉430071)

摘要:目的观察卵巢癌组织中微小RNA-204( miR-204)表达变化，以及miR-204对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响。方法选择卵巢癌患者50例，分别取其卵巢癌及相应癌旁组织;体外培养卵巢癌SKOV3细胞，随机分为1、2、3组，分别加入转染试剂、阴性对照载体、化学合成的双链miRNA-204表达载体;采用实时荧光定量PCR( qRTPCR)法检测组织及细胞中miRNA-204相对表达量;观察miRNA表达与卵巢癌患者临床病理特征的关系;采用流式细胞仪检测卵巢癌SKOV3细胞凋亡情况。结果卵巢癌组织中miR-204 mRNA相对表达量低于癌旁组织( P＜0.01) ; miR-204 mRNA表达与FIGO分期、淋巴结转移、CA125水平相关( P均＜0.05)。1、2、3组miRNA-204 mRNA相对表达量分别为2.35±0.67、2.01±0.45、5.32±0.88，3组较1、2组增加( P均＜0.05) ;细胞凋亡率分别为7.32%±1.40%、5.14%±1.90%、52.4%±9.10%，3组较1、2组增加( P均＜0.05)。结论卵巢癌组织中miRNA-204表达下调，且与病情进展相关; miRNA-204促进卵巢癌细胞凋亡，这可能是其发挥抑癌作用的机制之一。

关键词:卵巢肿瘤;卵巢癌;卵巢癌SKOV3细胞株;微小RNA-204;细胞凋亡

卵巢癌是女性生殖系统病死率最高的恶性肿瘤，早期无症状，缺乏有效的筛查手段，近70%的卵巢癌患者确诊时已属晚期，5年生存率低于30%［1］。CA125是目前卵巢癌诊断和预后判断最常用的血清标志物，但是CA125仅在50%的早期和70%～90%的晚期卵巢癌患者血清中增高，缺乏诊断特异性和敏感性［2］。微小RNA( microRNA)在肿瘤组织中性质稳定、功能广泛。研究发现，microRNA-204 ( miR-204)在子宫内膜样腺癌［3］、鼻咽癌［4］等肿瘤组织中表达明显降低，并与临床病理特征及预后相关;上调肿瘤细胞中miR-204，可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制迁移、增加对化疗药物的敏感性。但是，miR-204与卵巢癌的关系尚无相关报道。本研究观察卵巢癌组织中miR-204表达变化，以及miR-204对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2006年1月～2008年1月武汉大学中南医院收治的卵巢癌患者50例，年龄32 ～75岁、平均54岁;均行手术治疗，均未接受化疗或放疗;分别取其卵巢癌组织和相应的癌旁组织。手术切除标本立即放入液氮中保存，随后转入－80℃冰箱保存。

1.2细胞培养及分组卵巢癌SKOV3细胞株(上海细胞研究所)培养在37℃、5% CO2培养箱中，细胞培养液为含100 mg/mL链霉素、10%小牛血清、100 U/mL青霉素的RPMI 1640培养基，每隔2 d更换1次培养液。收集对数生长期SKOV3细胞，PBS冲洗3次，1 mL RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞密度为4×104/mL，转移细胞至24孔板继续培养10～12 h后，随机分为1、2、3组，分别加入转染试剂、阴性对照载体、化学合成的双链miRNA-204表达载体，继续培养4 h后换原培养液继续培养。

1.3卵巢癌组织及细胞中miRNA-204 mRNA检测

采用实时荧光定量PCR法。取冻存卵巢癌及其癌旁正常组织和三组转染后培养48 h的SKOV3细胞，加入TRIzol抽提RNA，按照Prime-ScriptTM逆转录试剂盒( TaKaRa公司)说明书逆转录成cDNA;取cDNA进行qRT-PCR检测。反应条件: 95℃预变性20 s; 95℃10 s，60℃20 s，共40个循环; 70℃延伸10 s。引物序列［4］: miRNA-204: (正义) 5'-AACCUGAUCCCGUCUGAGAUUG-3'，(反义) 5'-CCGGAUCAAGAUUAGUUCGGUU-3';内参β-actin: (正义) 5'-AGCGGGTCTGACGTAAAGCGA-3'，(反义) 5'-GTGGACGGGAGAGGACTGG-3'。采用2－ΔΔCt方法检测miRNA-204 mRNA相对表达量。卵巢癌组织中miRNA-204 mRNA相对表达量＜2.34为低表达，≥

2.34为高表达。

1.4细胞凋亡情况检测三组SKOV3细胞转染后培养48 h，分别取5×104～10×104重悬细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。随后加入5 μL Annexin VFITC，混匀，4℃避光孵育15 min。加入5 μL碘化丙啶染色液，混匀，4℃避光孵育5 min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算凋亡率。

1.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，比较采用Student's t检验或单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

卵巢癌组织中miR-204 mRNA相对表达量为2.34±0.92，癌旁组织为5.74±1.59;两者比较，P ＜0.01。miR-204 mRNA表达水平与卵巢癌FIGO分期、淋巴结转移、CA125水平相关( P均＜0.05)，与年龄、组织学分级、有无腹腔积液无关( P均＞0.05)，见表1。1、2、3组miRNA-204 mRNA相对表达量分别为2.35±0.67、2.01±0.45、5.32±0.88，3组较1、2组增加( P均＜0.05) ;细胞凋亡率分别为7.32%±1.40%、5.14%±1.90%、52.4%± 9.10%，3组较1、2组增加( P均＜0.05)。

表1　 miR-204 mRNA相对表达与卵巢癌患者临床病理特征的关系(例)

3　讨论

尽管卵巢癌的发病机制在蛋白及基因水平得到深入认识，手术、放化疗等为主的综合治疗有了长足的发展，但卵巢癌的早期诊断和预后没有明显进展。microRNA是一种长18～25个核苷酸的小分子单链RNA，可与靶信使RNA的3'非翻译区( 3'UTR)结合，通过诱导的沉默复合物抑制或降解靶信使RNA的翻译，负性调节靶基因转录后水平［5，6］。研究证实，microRNA参与卵巢癌的发生、发展过程［7，8］;有多种microRNA在卵巢细胞及组织中表达上调或下调，可作为卵巢癌的癌基因或抑癌基因，在卵巢癌细胞生长、分化、浸润及转移过程中发挥中至关重要的作用［9～11］。

miR-204作为一种新的抑癌或致癌基因，在不同肿瘤细胞中功能不同，其主要通过诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻译，调控相关靶基因表达，参与多种肿瘤的发生、发展等过程［12］。miR-204在前列腺癌中作为一种癌基因，在肿瘤组织或细胞中高表达，促进癌细胞增殖、转移;肿瘤组织中的miR-204与临床分期及预后明显相关，其高表达是提示预后差的独立影响因素;通过小干扰RNA沉默miR-204的表达可以促进前列腺癌细胞的凋亡［13］。在子宫内膜癌组织中miR-204表达下调，作为抑癌基因抑制肿瘤的发生、发展，与临床病理特征和预后相关［3］。通过转染上调miR-204在头颈部鳞状上皮细胞癌细胞株中的表达，可以抑制癌细胞的增殖和转移［14］。但是，miR-204在卵巢癌中的表达、功能目前尚不明确。

本研究发现，卵巢癌组织miR-204相对表达量低于癌旁组织，提示miR-204可能作为一种抑癌基因参与卵巢癌的发生、发展。进一步对卵巢癌患者临床病理参数分析发现，miR-204表达与FIGO分期、淋巴结转移、CA125水平相关。从细胞水平对miR-204在卵巢癌中的功能或作用机制进一步研究发现，转染miR-204至卵巢癌SKOV3细胞后，上调miR-204可以促进细胞凋亡。但是，miR-204通过何种机制促进细胞凋亡，还需要进一步研究。

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收稿日期:( 2014-10-23)

通信作者:周春，E-mail: zhouchun6@126.com

文章编号:1002-266X( 2015) 28-0055-03

文献标志码:B

中图分类号:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.024