体外高糖环境对H9C2心肌细胞增殖的影响及其机制探讨

卢海龙，杨荣礼，李雷(徐州医学院附属医院，江苏徐州221006)

体外高糖环境对H9C2心肌细胞增殖的影响及其机制探讨

卢海龙，杨荣礼，李雷
(徐州医学院附属医院，江苏徐州221006)

摘要:目的观察体外高糖环境对H9C2心肌细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法将体外培养鼠胚心肌细胞H9C2随机分为四组，1组培养液中加入终浓度为5.5 mmol/L的D-葡萄糖，2组加入终浓度为27.5 mmol/L的甘露醇和5.5 mmol/L的D-葡萄糖，3组加入终浓度为33 mmol/L的D-葡萄糖，4组加入终浓度为2 μmol/L的经典瞬时受体蛋白( TRPC)阻滞剂SKF96365和终浓度为33 mmol/L的D-葡萄糖。分别在培养24、48、72 h时，采用CCK8法测定细胞增殖率，实时定量PCR法测定经典瞬时受体蛋白6( TRPC6)、活化T细胞核因子3( NFAT3) mRNA; 72 h时采用Western blotting法检测TRPC6及NFAT3蛋白。结果培养72 h时1、2、3、4组细胞增殖率分别为105.88%±10.01%、98.67%±8.97%、28.55%±6.32%、49.18%±7.14%，3组较1、2组降低( P均＜0.05)，4组较3组增高( P＜0.05) ; 3组TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相对表达量较1、2组增加( P均＜0.05)，4组较3组下降( P均＜0.05)。结论高糖抑制心肌细胞增殖;促进心肌细胞TRPC6表达，导致TRPC通道开放，启动钙调神经素( CaN)/活化T细胞核因子( NFAT)通路，可能是其作用机制。

关键词:糖尿病心肌病;高糖;鼠胚心肌细胞株H9C2;经典瞬时受体蛋白6;活化T细胞核因子3

糖尿病心肌病( DCM)早期表现为舒张性左心功能不全，晚期容易并发恶性心律失常、心力衰竭、甚至猝死［1，2］。迄今为止，DCM发病机制仍不完全明确，治疗未有实质性突破［3］。研究发现，心肌细胞内钙超载与DCM的发生有关［4］。高血糖是糖尿病患者的主要特征之一，能够直接损伤心肌细胞，引起心肌病变［5］。但是，高血糖对心肌细胞内钙超载是否有促进作用及其可能机制，文献报道较少。2012年9月～2013年7月，本研究以体外培养的鼠胚心肌细胞H9C2为研究对象，观察体外高糖环境对细胞形态及增殖的影响，并探讨其作用机制。

1　材料与方法

1.1材料鼠胚心肌细胞H9C2购自中国科学院上海生命科学研究院。DMEM培养基、D-葡萄糖、胎牛血清( FBS) (美国Gibco公司)，细胞计数盒CCK-8(日本Dojindo Lab)，细胞总RNA提取试剂盒、核蛋白提取试剂盒、经典瞬时受体蛋白6( TRPC6)和GAPDH引物、DNA marker(上海生物工程有限公司)，实时定量PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)，兔抗大鼠TRPC6单克隆抗体、兔抗大鼠活化T细胞核因子3 ( NFAT3)单克隆抗体、经典瞬时受体通道蛋白( TRPC)通道阻滞剂SKF96365(以色列Alomone Labs公司)。

1.2细胞培养及分组处理H9C2细胞在含10% FBS的低糖( 5 mmol/L) DMEM培养基中培养，待细胞生长85%左右培养面积后，0.25%胰酶消化，1∶2传代，8～9代细胞用于实验。待细胞成对数生长后，调整细胞数为1×105/L，接种于6孔培养板，培养24 h;待细胞成融合状态换用无血清低糖DMEM培养基，继续培养24 h，使细胞呈静止状态，随机分为四组。1组:培养液中加入终浓度为5.5 mmol/L 的D-葡萄糖; 2组:培养液中加入终浓度为27.5 mmol/L的甘露醇和终浓度为5.5 mmol/L的D-葡萄糖; 3组:培养液中加入终浓度为33 mmol/L的D-葡萄糖; 4组:培养液中加入终浓度为2 μmol/L的SKF96365和终浓度为33 mmol/L的D-葡萄糖。

1.3细胞存活率检测将各组细胞接种于96孔培养板，分别在培养24、48、72 h时每孔加入CCK-8 10 μL和DMEM 90 μL，37℃、5% CO2条件下孵育1 h，采用酶标仪(λ= 450 nm)记录各孔光密度( OD)值，计算细胞增殖率。细胞增殖率( %) = (处理组OD450－空白孔OD450)/(对照组OD450－空白孔

OD450)×100%，每组设3个复孔，实验重复3次。空白孔为未加细胞悬液的DMEM培养液，1组即对照组。

1.4 TRPC6、NFAT3 mRNA检测采用实时定量PCR方法。各组细胞分别在处理24、48、72 h提取细胞总RNA，测定RNA浓度。TRPC6引物序列:上游: 5'-GTCGGTGGTCATCAACTACAATC-3'，下游: 5'-CCACATCCGCATCATCCTCAATT-3'; NFAT3引物序列:上游: 5'-ACAGAAGAGGGGGCGTCTC-3'，下游: 5'-ACCAATAGGGGCAGCACCATA-3'; GAPDH引物序列:上游: 5'-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3'，下游: 5'-TGGGGGCATCGGCAGAAGG-3'。PCR反应条件: 95℃变性5 min、95℃30 s、58℃30 s、70℃30 s，40个循环。实验重复3次。以GAPDH为内参照，2－ΔΔCt法计算各组TRPC6、NFAT3 mRNA相对表达量。

1.5 TRPC6、NFAT3蛋白检测各组细胞在培养72 h时(根据前期实验结果确定时间点)采用0.25%胰酶常规消化并收集，采用Western blotting法检测TRPC6( 1∶500)、NFAT3( 1∶2 000)蛋白。具体步骤参照试剂盒说明书。实验重复3次，以GAPDH作为内参照。采用Quantity-One软件分析各组TRPC6、NFAT3蛋白的相对表达量。

1.6统计学方法采用SPSS13.0统计软件。符合正态分布的计量资料采用珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组细胞增殖率比较在培养72 h时，3组细胞增殖率较1、2组降低( P均＜0.05)，4组较3组增高( P＜0.05) ; 3组72 h时细胞增殖率较48 h时降低( P＜0.05) ; 1、2组细胞增殖率在各时间点均无明显差异( P均＞0.05) ;见表1。

表1　四组不同时间点细胞增殖率比较( %，±s)

表1　四组不同时间点细胞增殖率比较( %，±s)

注:与同时间点1、2组比较，*P均＜0.05;与同时间点3组比较，△P＜0.05;与同组48 h比较，#P＜0.05。

组别　细胞增殖率24 h　48 h　72 h 1组25.72±1.89　 65.77±6.87　 105.88±10.01 2组　22.55±2.02　 61.92±5.99　 98.67±8.97 3组　16.78±1.36　 43.22±4.59　 28.55±6.32* #4组　18.79±2.65　 55.43±6.01　 49.18±7.14△

2.2各组TRPC6、NFAT3 mRNA相对表达量比较

在培养72 h时，3组TRPC6、NFAT3 mRNA相对表达量较1、2组增加( P均＜0.05)，4组较3组下降( P均＜0.05) ; 3组各时间点比较，P均＜0.05;见表2。

表2　四组不同时间点TRPC6、NFAT3 mRNA相对表达量比较(±s)

表2　四组不同时间点TRPC6、NFAT3 mRNA相对表达量比较(±s)

注:与同时间点1、2组比较，*P均＜0.05;与同时间点3组比较，△P＜0.05;与同组各时间点比较，#P＜0.05。

组别TRPC6 mRNA 24 h　48 h　72 h NFAT3 mRNA 24 h　48 h　72 h 1组　1.03±0.13　0.96±0.09　1.02±0.11　0.97±0.17　0.99±0.13　1.06±0.19 2组　1.07±0.08　1.12±0.15　1.09±0.26　1.14±0.14　1.11±0.11　1.13±0.18 3组　7.23±0.52　11.39±1.17　16.15±1.49* #　5.23±1.43　9.88±1.96　14.44±2.09* #4组　4.64±0.35　6.79±0.44　10.13±0.69#　2.94±0.24　5.32±0.94　8.97±1.73△

2.3各组TRPC6、NFAT3蛋白相对表达量比较在培养72 h时，1、2、3、4组TRPC6蛋白相对表达量分别为0.302±0.017、0.351±0.023、1.874± 0.124、1.214±0.097; NFAT3蛋白相对表达量分别为0.247±0.026、0.298±0.034、1.199±0.104、0.656±0.038; 3、4组均高于1、2组( P均＜0.05)，4组均低于3组( P均＜0.05)。

3　讨论

研究发现，持续高血糖状态会造成心肌细胞胞质内、线粒体内Ca2 +浓度明显升高，导致心肌细胞舒缩功能障碍及凋亡增加［5，6］。在病理状态下，胞外钙的内流和胞内钙库的释放则造成细胞质内钙超载［7］。细胞外钙内流主要通过电压门控钙信道( VOC)、受体门控钙通道( ROC)和钙库操纵性钙通道( SOC)，其中VOC和ROC主要介导胞外钙在短时间内大量内流，SOC则介导小量持续钙内流。但是，组成SOC及ROC的具体分子实体仍不十分明确。研究发现，TRPC的同源异构体是构成细胞膜上SOC和ROC的分子实体，TRPC通道的启动开放可引起心肌细胞内Ca2 +浓度变化，通过钙调神经素( CaN)/NFAT信号通路在细胞内Ca2 +增加诱导的心肌重构过程中发挥关键作用，进而触发心肌肥大相关信号转导，引起心肌重构和病理性肥厚［8］。Onohara等［9］发现，血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)诱导的新生大鼠心肌细胞肥大模型TRPC3、TRPC6 mRNA表达均显著上调;而敲除TRPC3 或TRPC6中的任何一个，都会明显抑制心肌细胞肥大效应; PLC介导的1，2-二酰甘油( DAG)的生成增多对上述过程有直接启动作用。TRPC3与TPRC6均可直接受DAG的启动开放，TRPC3与TRPC6通道之间有协同关系。研究发现，TRPC6表达程度与心肌细胞

肥大密切相关，并且证实这种促进心肌细胞肥大的效应是由TRPC介导的Ca2 +-NFAT信号通路完成［7］。在CaN被持续启动后，小鼠心肌细胞膜TRPC6表达量明显增加;在人类心力衰竭的心肌细胞中，TRPC6亦出现类似过表达。Nishida等［10］研究发现，内皮素-1( ET-1)、AngⅡ刺激体外大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞，可以显著提高TRPC6的表达水平;血小板凝结抑制剂Forskolin可以显著下调TRPC6表达; ET-1的这种作用是由Gα12/13( G-12家族蛋白的亚单位)所介导的，并且这种作用通过NFAT的持续激活持续启动。进一步研究发现，过表达TRTRPC6的转基因小鼠NFAT的转录活性增强，并参与Ca2 +-CaN/NFAT信号通路的正回馈机制，通过抑制5型磷酸二酯酶途径抑制TRPC6表达活性增加造成的病理性心肌肥大［11］。高糖通过增加人类足突细胞黏连蛋白聚糖-4( SDC-4)和活性氧簇( ROS)的表达调节TRPC6的表达［12］。没有基础心脏病的Klotho基因缺陷小鼠会出现应激状态下的心肌细胞肥大和心室重构;在健康成年小鼠的心肌细胞中，Klotho通过下调TRPC6而发挥心脏保护作用［13］。如果抑制Klotho基因缺陷小鼠TRPC6蛋白的表达，则可以阻止压力诱导的心肌细胞重构。进一步研究发现，TRPC6高表达的小鼠会自发出现心肌重构;而Klotho过表达则可以明显抑制TRPC6导致的心肌重构，延长小鼠生存期。Kinoshita等［14］证明，TPRC6蛋白是心钠肽/脑钠肽-鸟苷酸环化酶A ( ANP/BNP-GC-A)信号通路介导的心肌肥大作用的关键靶点。上述研究均证明，TRPC6在心肌肥厚的发生、发展过程中发挥重要的桥梁作用。

高糖可使心肌细胞内Na+-K+-ATP酶、Ca2 +-Mg2 +活性减低，使心肌细胞对钙的摄取和输送能力下降，导致心肌收缩功能受损。但高糖是否会通过上调TRPC蛋白的表达，导致胞内钙超载，从而启动CaN/NFAT信号通路，目前国内外尚无相关研究予以证实。

H9C2细胞源于胚胎期大鼠心脏，具有心肌细胞的很多特性; 33 mmol/L葡萄糖作为研究心肌细胞高糖损伤的条件，已经被广泛证实并应用［15］。本研究将H9C2心肌细胞在33 mmol/L葡萄糖条件下培养，细胞出现肥大、变性、坏死，增殖率降低，说明高糖造成细胞损伤。在培养72 h时，3组TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相对表达量较1、2组增高;加用TRPC通道阻滞剂skf96365后，心肌细胞增殖率有所增加，TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相对表达量下调。上述结果提示，在高糖条件下TRPC6可能通过CaN/NFAT3通路造成心肌细胞损伤。

综上所述，高糖抑制心肌细胞增殖，造成心肌细胞损伤;促进心肌细胞TRPC6表达，导致TRPC通道开放，引起心肌细胞内钙超载，启动CaN/NFAT3通路，可能是其作用机制。

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收稿日期:( 2014-12-30)

通信作者:杨荣礼，E-mail: yrl6502@ sina.com

基金项目:徐州市科技计划项目( KC14SH110)。

文章编号:1002-266X( 2015) 28-0024-03

文献标志码:A

中图分类号:R541

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.008