不同浓度LBH589对人前列腺癌PC3细胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表达的影响

韦士勤，李常颖，李保国，李建民，王丽丽，王海涛( 天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060;天津医科大学第二附属医院，天津泌尿外科研究所)

不同浓度LBH589对人前列腺癌PC3细胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表达的影响

韦士勤1，李常颖2，李保国1，李建民2，王丽丽1，王海涛1
( 1天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060;2天津医科大学第二附属医院，天津泌尿外科研究所)

摘要:目的观察不同浓度组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对人前列腺癌PC3细胞增殖、EZH2 mRNA及蛋白表达的影响。方法选择1、10、100 nmol/L的LBH589处理PC3细胞，采用MTT法测算细胞增殖抑制率，实时定量PCR、Western blotting法分别检测细胞EZH2的mRNA和蛋白。结果随着浓度和时间的增加，LBH589对PC3细胞的抑制作用呈现明显的时间-剂量关系( P均＜0.05)。相同时间时，随着LBH589浓度的增加，PC3细胞EZH2的mRNA、蛋白表达逐渐降低( P均＜0.05) ;相同浓度时，随着时间的延长，PC3细胞EZH2的mRNA、蛋白表达逐渐降低( P均＜0.05)。结论LBH589可抑制PC3细胞的增殖，同时可使细胞EZH2的mRNA及蛋白表达降低，且随着浓度的增加作用增强。

关键词:前列腺肿瘤;去乙酰化酶抑制剂;细胞增殖;多梳蛋白zeste基因增强子类同源物2

组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰是基因转录调控的关键机制，与肿瘤的发生发展关系密切。组蛋白

乙酰化状态由组蛋白乙酰化酶( HATs)和组蛋白去乙酰化酶( HDACs)调节［1］。多梳蛋白zeste基因增强子类同源物2( EZH2)是多梳抑制复合物( PRC2)的催化亚基，是一种高度保守的组蛋白甲基转移酶，能使组蛋白3第27位赖氨酸( H3K27)三甲基化［2］。EZH2在转移性前列腺癌中呈现高表达［2］，并且EZH2的高表达可以抑制多种肿瘤抑制基因的表达从而促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。目前EZH2抑制剂的研究在转移性前列腺癌方面尚处于临床前研究阶段。PRC2与HDACs在结构和功能上具有联系［3］，因此是否可以通过HDACs抑制剂的作用来抑制EZH2的活性有待研究。LBH589是一种新型的广谱HDACs抑制剂，本研究观察了不同浓度LBH589对人前列腺癌PC3细胞增殖及EZH2表达的影响。

1　材料与方法

1.1细胞与试剂人前列腺癌细胞系PC3由天津医科大学第二附属医院泌尿研究所提供。胎牛血清、DMEM培养基购自Gibico公司;四甲基偶氮唑盐( MTT)、LBH589购自Sigma公司(将LBH589溶解于DMSO，稀释为10 μmol/L备用)。兔抗人EZH2多克隆抗体。

1.2 PC3细胞培养和传代将PC3细胞置于10%胎牛血清+ DMEM +双抗(青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)完全培养基中，37℃、5% CO2、饱和湿度孵箱培养。0.25%胰酶消化，2～3 d传代1次。

1.3 PC3细胞增殖抑制率检测采用MTT法。取培养至对数生长期的PC3细胞以5×103/mL的密度接种于96孔板，每孔200 μL，每组设3个复孔，置于37℃、5% CO2、饱和湿度孵箱中培养。待24 h细胞贴壁后，弃去培养液，实验组加入LBH589使其终浓度分别为1、10、100 nmol/L，并设对照组和调零孔。各组分别作用24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT( 5 mg/mL)，继续孵育4 h。吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜( DMSO)。在平板摇床摇10 min待紫色结晶溶解后，全波长扫描多功能读数仪检测各组490 nm波长处每孔的光密度( OD)值。按下列公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率= ( 1－实验组OD平均值/对照组OD平均值)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.4 PC3细胞EZH2 mRNA检测方法采用实时定量PCR。取对数生长期PC3细胞，实验组分别加入终浓度为1、10、100 nmol/L的LBH589继续培养24、48 h。同时设立空白对照组。取实验组及空白对照组PC3细胞。按照TRIzol RNA提取说明书操作法提取总RNA。经紫外分光光度法鉴定、定量后，分别取总RNA 1 μg，按逆转录试剂盒说明书操作，逆转录反应合成cDNA。以反应所得cDNA进行SYBR实时定量PCR扩增。GAPDH上游引物: 5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3'，下游引物: 5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'。EZH2上游引物: 5'-AGGACGGCTCCTCTAACCAT-3'，下游引物: 5'-CTTGGTGTTGCACTGTGCTT-3'。扩增条件为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃继续延伸5 min，共30个循环。溶解曲线为单一峰，mRNA相对表达量结果以2－ΔΔCt表示。

1.5 PC3细胞EZH2蛋白检测方法采用Western blotting法。取上述实验组及空白对照组PC3细胞，胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤2次，加入高效RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂( PMSF) ( 10∶1)，冰上裂解1 h，每隔15 min振荡器上震荡1次，12 000 g离心10 min后收集上清，BCA法行蛋白定量，取20 μg蛋白于10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶( SDS-PAGE)电泳分离，蛋白质转移至PVDF膜，5%牛奶室温封闭1 h，TBST洗膜5 min× 3次，加入EZH2一抗、鼠抗人β-actin工作浓度1∶1 000，4℃孵育过夜; TBST漂洗，加入1∶10 000辣根过氧化物酶( HRP)标记的二抗羊抗兔IgGHRP，HRP标记的二抗羊抗鼠IgG-HRP，室温摇床孵育1 h，TBST洗5次，每次10 min。最后用ECL化学发光试剂和胶曝光机曝光，以GAPDH为内参对照，计算各组细胞EZH2蛋白相对表达量。

1.6统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

随着浓度和时间的增加，LBH589对PC3细胞的抑制作用呈现明显的时间-剂量关系( P均＜0.05)，结果见表1。各组PC3细胞EZH2 mRNA、蛋白表达比较见表2。相同时间时，随着LBH589浓度的增加，PC3细胞EZH2的mRNA、蛋白表达逐渐降低( P均＜0.05) ;相同浓度时，随着时间的延长，PC3细胞EZH2的mRNA、蛋白表达逐渐降低( P均＜0.05)。

3　讨论

前列腺癌是男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，在欧美地区其发病率居男性恶性肿瘤首位，近年来我国前列腺癌发病率呈逐年上升的趋势［4］。目

表1　不同浓度LBH589对PC3细胞增殖的抑制作用(±s)

表1　不同浓度LBH589对PC3细胞增殖的抑制作用(±s)

LBH589 ( nmol/L)细胞增殖抑制率( %) 24 h　48 h　72 h 1 16.32±0.20　 24.27±0.30　 35.11±0.32 10　25.02±0.03　 35.64±0.17　 44.02±0.20 100　56.00±0.49　 67.64±0.74　 84.55±0.73

表2　各组PC3细胞HDAC1、HDAC2、EZH2 mRNA及蛋白表达比较(±s)

表2　各组PC3细胞HDAC1、HDAC2、EZH2 mRNA及蛋白表达比较(±s)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05。

组别EZH2 mRNA 蛋白实验组1 nmol/L LBH589 24 h　0.51±0.03　0.56±0.06 48 h　0.19±0.11*　0.25±0.04*10 nmol/L LBH589 24 h　0.39±0.08　0.45±0.03 48 h　0.12±0.05*　0.19±0.04*100 nmol/L LBH589 24 h　0.35±0.17　0.39±0.02 48 h　0.08±0.17*　0.12±0.06*空白对照组1.00±0.00　0.91±0.12

前前列腺癌的治疗包括手术切除、内分泌治疗及辅助治疗，其中中晚期前列腺癌以内分泌治疗为主。我国大多数前列腺癌在诊断时已处于中晚期，虽然内分泌治疗可以使大多数患者的病情得到控制和改善，但在经过中位时间为18～24个月的缓解期后，绝大多数患者会发展为去势难治性前列腺癌( CRPC)。CRPC患者预后极差，对传统治疗的有效率仅为10%～20%，因此迫切需要寻找新的治疗靶点。

近年来研究发现，表观遗传调控因子PcG蛋白表达异常与肿瘤的发生、发展密切相关，而其核心成分EZH2也受到更多的关注。EZH2主要起组蛋白甲基转移酶的作用，能使H3K27侧链上的ε氨基发生三甲基化。H3K27三甲基化被认为是在PcG沉默机制中起作用的主要存在形式。三甲基化后的H3K27能将PRC1复合物招募到特定基因位点，从而沉默与细胞分化、抑制增殖在内的基因，导致肿瘤的发生。EZH2在前列腺癌、乳腺癌、胶质瘤等一系列的肿瘤组织中高表达［5］，在良性前列腺肿瘤、局限性前列腺癌无表达或弱表达，而在转移性前列腺癌中高表达［6］。EZH2的高表达可以抑制多种肿瘤抑制基因的表达从而促进肿瘤的增殖、侵袭和转移［7］。目前EZH2抑制剂有竞争性的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂DZNep和EZH2竞争性抑制剂GSK126、UNC1999等［8］。EZH2抑制剂目前主要用于淋巴瘤的研究［9］，在前列腺癌的治疗中尚处于临床前研究阶段。Kirk等［10］发现依托泊苷联合EZH2抑制剂GSK126或DZNep可明显促进鼠前列腺癌细胞凋亡，但尚不能满足于临床治疗。

PRC2与HDACs在结构和功能上具有联系［11］，PRC2有组蛋白乙酰转移酶活性，在人类细胞中PRC2的结构与HDAC1和HDAC2相关联。虽然大量生化研究证明HDAC不是组成PRC2的核心元件，但两者之间短暂的相互作用可影响相关的转录酶表达。本研究结果发现，LBH589对PC3细胞具有明显的增殖抑制效应，抑制作用有明显的时间-剂量依赖性。且实时定量PCR及Western blotting结果显示，不同浓度LBH589可以明显降低EZH2的表达，且有明显的时间-剂量依赖性。

综上所述，LBH589可抑制PC3细胞的增殖，同时可使细胞EZH2表达降低，且随着浓度的增加作用增强。

参考文献:

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［8］McCabe MT，Creasy CL.EZH2 as a potential target in cancer therapy［J］.Epigenomics，2014，6( 3) : 341-351.

［9］McCabe MT，Ott HM，Ganji G，et al.EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations［J］.Nature，2012，492( 7427) : 108-112.

［10］Kirk JS，Schaarschuch K，Dalimov Z，et al.Top2a identifies and provides epigenetic rationale for novel combination therapeutic strategies for aggressiveprostate cancer［J］.Oncotarget，2015，6 ( 5) : 3136-3146.

［11］Volkel P，Dupret B，Le Bourhis X，et al.Diverse involvement of EZH2 in cancer epigenetics［J］.Am J Transl Res，2015，7( 2) : 175-193.

收稿日期:( 2015-05-21)

文章编号:1002-266X( 2015)31-0032-03

文献标志码:A

中图分类号:R737.25

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.012

通信作者:王海涛

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81301949) ;天津市卫生行业重大公关项目( 14KG141) ;天津市科技计划项目( 13ZCZCSY20300)。