Parkin基因在帕金森疾病中的作用机制

严陶陶

Parkin基因在帕金森疾病中的作用机制

严陶陶

【摘要】目的以原代细胞和PC12细胞为载体，考察Parkin基因在帕金森疾病中的作用机制。方法 对比Parkin基因正常表达与基因沉默时神经细胞被MPP+诱导凋亡过程中的差异。结果 使用MPP+进行处理，发现细胞膜通透性变大，表明了MPP+确实诱导大量细胞凋亡。 结论Parkin蛋白无法正常表达可能引起帕金森疾病。

【关键词】1-甲基-4-苯基-吡啶；Parkin基因；基因沉默；帕金森病

作者单位： 116024 大连理工大学

Parkin Gene Mechanisms in Parkinson's Disease

YAN Taotao, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China

[Abstract]Objective In order to the original generation cells and PC12 cells as the carrier, to explore the role of Parkin gene in Parkinson's disease mechanism. Methods compare the normal Parkin gene expression and gene silencing of nerve cells was the differences in the process of MPP+induced apoptosis. Results Parkinson's disease is caused by parkin protein innormal expression. Conclusion In order to reveal the genetic type of the molecular mechanism of Parkinson's disease to make a certain contribution.

[Key words]1-methyl-4-phenyl-pyridine, Parkin gene, Gene silencing, Parkinson's disease

1 原代神经细胞中Parkin基因对帕金森症的影响

1.1实验方法

1.1.1全脑、中脑及海马细胞的培养 将小鼠全脑、中脑及海马部位的神经细胞置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养7～15天，培养基是DMEM补加10%灭活胎牛血清、130 mg/L青那霉素。

1.1.2MPP+对细胞的损伤 获取全脑、中脑及海马神经细胞，取处于对数期生长的细胞进行实验，向细胞中加入剂量分别为0.1 µM、1 µM、10 µM的MPP+，与细胞培养48小时，收集细胞。通过免疫组化染色，观察三个部位神经细胞的形态学变化。同时，通过MTT比色法，向上述中收集的经MPP+处理过的细胞中加入MTT，使其终浓度为0.5 mg/ml，再将96孔板置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养3小时。然后将MTT连同培养基一同用移液枪吸取弃去，并向每孔中加入200 µl二甲基亚砜（DMSO）溶解蓝紫色结晶物，用酶标仪在570 nm处测定吸收度，计算细胞活力。

1.1.3Caspase-3,9活性的检测 取对数生长期状态下的细胞进行实验。向细胞中加入剂量为10 µM的MPP+[1]，与细胞培养48小时，收集细胞，并检测Caspase-3，9活性。将收集到的细胞用冷PBS冲洗三次，并重悬在裂解液中，于冰上放置40分钟。然后将悬液离心5分钟。分别以AC-DEVD-AMC、ACLEHD-AFC为荧光底物，将含有50 µg蛋白的裂解物与100 µM底物在37℃孵育1小时。然后用7620型荧光分光光度计检测光密度，即可间接

反应Caspase-3的活性。实验结果以实验组与对照组的比值作为Caspase的活性指标，对比各组间的差别。

1.1.4Western blotting检测Parkin的表达 向全脑、中脑及海马脑组织中分别加入剂量为10 µM的MPP+培养48 h后，收集细胞，均加入适当细胞裂解液。用Lowery法测定样品中的蛋白浓度，取等量蛋白做十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳到预定位置后，用DYCP半干式转膜仪将蛋白条带印迹到PVDF膜上。转膜前，将PVDF膜浸在甲醇中1分钟，然后在转膜缓冲液中浸泡5分钟；印迹后的膜用含5%小牛血清的TBS（20 mmol/ml Tris-HCl缓冲液，pH 7.5，150 mmol/mL NaCl）封闭2 h(室温)，然后加入β-actin抗体、parkin抗体摇床4℃孵育过夜（12～24 h)。次日，用加0.1%Tween-20 的TBS洗膜三次，每次5分钟；接着用辣根过氧化物酶标记的IgG孵育1小时，洗膜后用DAB控制显色，凝胶成像系统扫描分析斑点面积。

1.2实验结果

1.2.1MPP+对全脑、中脑及海马细胞的形态学的影响 在显微镜下观察MPP+对各部位细胞的损伤程度[2]，可以得出，海马细胞与全脑细胞形态均无太大变化，而中脑细胞形态变化较大，即已受到很大损伤，说明中脑细胞对MPP+等神经性药物更为敏感。

1.2.2 MTT检测细胞活力 对细胞应用MTT比色法，检测细胞的存活与生长，对比不同剂量的MPP+作用48小时后的细胞存活数据可以看出，同种细胞的损伤程度随MPP+呈剂量依赖性。而观察加入相同剂量的MPP+时，三种细胞的损伤程度始终是中脑细胞最严重，进一步证明了1.2.1的结论即中脑细胞对MPP+等神经性药物更为敏感，中脑部位脑组织在MPP+剂量为10 µM时活性下降了34.8%。

1.2.3MPP+对半胱氨酸酶凋亡通路活性的影响 在MPP+的作用下，三个部位细胞中的Caspase-3,9均被显著激活，且中脑细胞中酶活性上升最为显著，说明MPP+参与激活Caspase凋亡通路而引起细胞大规模凋亡。

1.2.4MPP+对Parkin表达量的影响 与正常细胞Parkin蛋白含量相比，在加入MPP+后，全脑和海马细胞中Parkin表达均有少量减弱但并不是非常明显，中脑细胞中Parkin含量骤降，这表明MPP+对中脑影响最大，且影响Parkin的正常表达。

2　PC12细胞中Parkin基因对帕金森症的影响

2.1实验方法

2.1.1PC12细胞的培养 将PC12细胞在37℃、5%CO2的孵箱中培养，培养基是DMEM补加10%灭活胎牛血清、100 U/ml 青霉素，100 mg/l链霉素。隔天换液。

2.1.2诱导基因沉默 用小细胞培养瓶（底面积为10 cm2）培养细胞[3]至对数生长期，将Parkin蛋白的小干扰RNA分别通过lipo2 000转入正常培养且处于对数生长期的PC12细胞内，48小时后，收集细胞，检测小RNA干扰后的细胞中Parkin蛋白含量。

2.1.3乳酸脱氢酶（LDH）的释放 用10µM的MPP+处理基因沉默后的PC12细胞，培养48小时。使用LDH检测试剂盒检测细胞培养基中的代谢物乳酸脱氢酶的释放率。

2.1.4凋亡小体的检测 观察MPP+处理48小时前后细胞的形态变化。将MPP+处理48小时后的PC12细胞用Hoechst33258进行染色，在荧光显微镜下观察检测凋亡小体。将实验组与阴性对照组细胞中的荧光反应相对比，观察荧光强弱以及是否出现荧光强的凋亡小体。

2.2实验结果

2.2.1Parkin基因沉默 对比Parkin蛋白的条带能够发现，转入小干扰RNA的细胞中的Parkin蛋白含量与未转入小干扰RNA的细胞相比明显减少，说明小干扰RNA已经成功致使Parkin基因沉默无法正常转录表达。

图1　MPP+对Parkin基因沉默的PC12细胞的影响

图2　MPP+对Parkin基因沉默后细胞的LDH释放的影响

图3　MPP+对凋亡小体形成的影响

2.2.2MTT检测细胞活力 在经过MTT比色法检测后，我们

发现与阴性对照组细胞相比，基因沉默后的PC12细胞活力更低，说明Parkin基因无法正常表达时，MPP对细胞活力的影响更大。在加入MPP+剂量为100 µM时基因沉默PC12细胞的细胞活性下降了81.4%。而对比加入不同剂量MPP+，基因沉默后的PC12细胞的细胞活力随MPP+剂量的升高而下降，即细胞受损程度与MPP+呈现剂量依赖性，剂量越高受损越严重（图1）。

2.2.3LDH释放量检测 对Parkin基因沉默后的细胞进行MPP+处理后，检测细胞液中LDH含量，LDH含量与MPP+呈现剂量依赖性并随之升高，同时LDH含量与阴性对照组细胞相比有所上升，说明细胞膜通透性变大（图2）。

2.2.4凋亡小体的检测 在光学显微镜下可观察MPP+处理48小时后，部分细胞表现出凋亡的特征：细胞皱缩，胞体由梭型渐渐变圆。用Hoechst33258进行染色后，通过对比可以发现，当高剂量MPP+对基因沉默的PC12细胞进行诱导时，荧光明显增多，即凋亡小体大量出现，表明MPP+加速了细胞凋亡（图3）。

3　总结

在Parkin基因[4]正常表达时，不同剂量MPP+会对同种细胞造成不同程度的损伤，且细胞的损伤程度随MPP+呈剂量依赖性、剂量增大而增大。加入相同剂量的MPP+时，三种细胞的损伤程度总是中脑细胞最严重，即中脑细胞对MPP+等神经性药物更为敏感。

在Parkin基因正常表达时，加入MPP+处理细胞，与细胞凋亡密切相关的半胱氨酸酶（Caspase）活性大幅上升，以富含多巴胺能神经元的中脑神经细胞中Caspase活性上升最为明显。MPP+参与激活Caspase级联反应，可以加速细胞凋亡和裂解。同时，Parkin含量在MPP+处理后大量减少，说明MPP+影响了Parkin的正常表达。

在Parkin基因沉默的状态下，加入MPP+后，细胞中乳酸脱氢酶（LDH）的释放量及凋亡小体含量均呈上升趋势，Caspase级联反应被激活，细胞活力明显下降，细胞凋亡通路激活。Parkin基因的沉默表达可能引发细胞凋亡，进而引起帕金森症的发病。

参考文献

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.25.042

【文章编号】1674-9308（2015）25-0061-03

【文献标识码】B

【中图分类号】R741.02