基于变应原致敏组分T细胞表位的肽段免疫治疗

姜楠楠，尹　佳

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院变态反应科，北京 100730)

变应原特异性免疫治疗是唯一可以改变变态反应疾病进程的治疗方法[1]，不仅用于吸入变应原引起的鼻炎和哮喘以及蜂毒所致的过敏性休克等疾病的治疗[2]，还能阻止过敏性鼻炎发展为哮喘[3]。治疗机制主要包括阻断抗体(IgG4、IgA等)的产生，诱导外周T细胞耐受以及抑制效应细胞活化等[4]。传统免疫治疗应用的变应原提取液含有完整的变应原分子，这些分子的B细胞表位结合导致效应细胞(肥大细胞、嗜碱性粒细胞等)上变应原特异性IgE桥联，导致不良反应的发生，有些不良反应甚至是致命的[1]，这使传统变应原免疫治疗的应用存在局限性。目前已发表了多种为降低免疫治疗制剂变应原性，同时维持其免疫原性的方法，比如利用重组变应原或其组分，合成T细胞或B细胞表位肽段，变应原分子的物理修饰[与Toll样受体(Toll-like rceptor,TLR)的配体偶联，与含有CpG基序的DNA片段的偶联等]以及佐剂(单磷酰脂质A、氢氧化铝、碳水化合物基等)的使用，DNA疫苗等[5- 6]。近年来已有多项研究评估基于变应原优势T细胞表位的合成肽段进行免疫治疗的疗效，包括动物实验和临床研究[7]。本篇文章将对近年来发表的基于T细胞表位的合成肽段进行免疫治疗的文献进行综述。

T细胞表位肽段免疫治疗的动物实验及潜在的免疫学机制

早期的肽段免疫治疗(peptide immunotherapy)研究主要关注自身免疫疾病(自身免疫性脑膜炎[8]、关节炎[9]、系统性红斑狼疮[10]等)，近年来在糖尿病[11]、恶性肿瘤[12]等领域也有研究。肽段免疫治疗用于变态反应性疾病治疗的研究相对发展较晚，近年多种气传变应原和食物变应原主要致敏组分的T细胞表位已被鉴定，为变应原特异性免疫治疗奠定了基础[13-14]。

同传统特异性免疫治疗机制相似，动物实验中T细胞表位肽段免疫治疗的主要机制包括诱导外周T细胞耐受以及抑制效应细胞活化等。Hoyne等[15]用屋尘螨主要致敏组分Der p1致敏的小鼠，予鼻内吸入低剂量包含其优势T细胞表位的肽段Der p1(氨基酸111～139)治疗，体外变应原刺激发现特异性T细胞增殖受到抑制，白细胞介素(Interleukin,IL)2和抗体产生量减少。Briner等[16]用来源猫毛主要致敏组分Fel d1的多肽(IPC-2)对Fel d1致敏的B6CBAF1小鼠进行皮下脱敏治疗，结果亦显示IL-2和特异性IgG产生减少。Astori等[17]在蜂毒过敏的CBA/J小鼠模型中，给予鼻内吸入涵盖有磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)全序列的三种长肽段混合物，可诱导小鼠对PLA2的特异性T细胞的免疫耐受，细胞免疫反应显示由Th2型向Th1型偏倚，特异性IgE水平降低，King等[18]对BALB/c小鼠分别皮下注射包含蜂毒T细胞表位的肽段Api m4(氨基酸7～19)，Api m4致敏后，T细胞活化受到抑制，Api m4特异性IgE水平下降40%～65%，同样品系的小鼠用胡蜂蜂毒的主要致敏原组分Dol m5(氨基酸41～60、141～160、176～195)三条肽段进行皮下注射，随后用Dol m5致敏，Dol m5 sIgE水平在免疫反应的早期阶段下降40%。而Campbell等[19]用Fel d1致敏小鼠转基因表达人的HLA-DRB*0101分子后，以肽段 Fel d1(氨基酸29～45)治疗，发现小剂量(1 μg)的肽段治疗即可降低小鼠气道高反应性，减少Th2型细胞因子及特异性IgE的产生，黏液分泌和气道嗜酸粒细胞浸润减少，该研究还发现免疫治疗不仅可诱导T细胞对该肽段产生耐受，也同时诱导T细胞对该分子的其他肽段产生耐受，T细胞耐受依赖于IL-10。Bauer等[20]用Bet v1 T细胞表位肽段(氨基酸139～152)皮下注射治疗Bet v1致敏的CBA/J小鼠，可下调T细胞诱导的免疫反应。Hiroi等[21]用表达柳杉主要致敏组分Cry j1和Cry j2优势T细胞表位的转基因大米治疗日本柳杉致敏的小鼠，可诱导小鼠对上述两种致敏组分产生免疫耐受，在抗原激发后，小鼠鼻部症状减轻，外周血抗原特异性IgE水平降低，CD4+T细胞增殖受到抑制，Th2型的细胞因子(IL- 4、IL-5、IL-13)及组胺释放减少。最近的一项研究显示，Kawabe等[22]对柳杉致敏的小鼠进行口服表达Cry j1优势T细胞表位的转基因鸡蛋白的治疗后，Cry j1特异性IgE和总IgE水平降低。

除了吸入性变应原的T细胞表位肽段免疫治疗的研究，近年来，有研究开始关注食物变应原的T细胞免疫治疗，主要是鸡蛋、花生、虾等致敏组分的肽段免疫治疗研究。Rupa等[23]对鸡蛋卵类黏蛋白(ovomucoid，OVM)致敏小鼠进行口服单个T细胞表位和多种T细胞表位免疫治疗，结果显示两组小鼠免疫治疗后临床症状均得到改善，OVM血清特异性IgE降低而特异性IgA升高，Th2型的细胞因子IL- 4、IL-10浓度降低，单个T细胞表位治疗组小鼠外周血CD4+Foxp3+T细胞和CD4+CD25+T细胞增多。Yang等[24]对鸡蛋卵清蛋白(ovalbumin，OVA)致敏的小鼠用OVA的3个优势T细胞表位进行皮下免疫治疗，OVA激发后，3种T细胞表位的肽段混合治疗的小鼠，临床症状积分显著下降，同时血清中组胺和OVA特异性IgE的浓度降低，小鼠脾脏细胞和小肠上皮细胞Th1型的细胞因子[干扰素γ(interferon-γ](IFN-γ)分泌减少，而Th2型细胞因子(IL- 4)分泌增多，同时转化生长因子β(transforming grouth foutor-β,TGF-β)和Foxp3的mRNA表达增多，以上结果显示黏膜局部的调节性T细胞在免疫耐受中起着重要作用。Su等[25]对OVA致敏的小鼠用OVA单个优势T细胞表位(氨基酸323～339)八聚体进行皮下免疫治疗后，小鼠外周血、纵隔淋巴结以及脾脏中CD4+CD25+Foxp3+的调节性T细胞增多，肺泡灌洗液中IL-10水平增高，肺组织中IL-10、TGF-β以及Foxp3的表达上调，同时肺泡灌洗液中OVA特异性IgE水平降低，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润减少，而在同样的动物模型中用单一包含有T细胞表位OVA肽段进行免疫治疗则没有上述改变，显示肽段的多聚体比单一肽段在免疫调节方面可能更有优势。Wai等[26]鉴定了虾的主要致敏组分Met e1 T细胞表位，并用T细胞表位肽段口服治疗虾过敏的模型小鼠，临床症状明显改善，Th2免疫反应受抑制，特异性IgE水平下降，同时IgG2a水平升高，Th2型细胞因子(IL- 4、IL-5、IL-13)水平下降。

T细胞表位肽段免疫治疗的临床研究

肽段免疫治疗在临床的研究进展相对较慢，目前已开展在多发性硬化病、1型糖尿病[27]、类风湿性关节炎[28-29]等领域的临床研究。在变态反应性疾病领域内肽段免疫治疗还仅局限于猫毛过敏和蜂毒过敏，其他变应原的肽段免疫治疗的临床试验正在进行中(http：//www.circassia.co.uk)。

Fel d1 T细胞表位肽段治疗猫毛过敏患者安全性和有效性评价

1993年，Briner等[16]鉴定出猫毛的致敏组分Fel d1的T细胞表位，随后研制出第一个应用于临床的肽段疫苗(Allervax Cat)，Allervax Cat由两条包含有Fel d1 T细胞表位的27个氨基酸的肽段组成(IPC-1和IPC-2)，多项研究对其治疗的有效性和安全性进行了评价。1996年，Norman等[30]发表了第一个随机对照研究，将95例猫毛过敏的患者按剂量不同随机分为4组(安慰剂组、7.5 μg、75 μg、750 μg)，患者共注射4次，每周1次，治疗结束6周后，75 μg和750 μg治疗组肺和鼻部症状积分均有降低。Pene等[31]的研究中，25例猫毛过敏的患者接受6周(每周1次)Allervax Cat(7.5、75、750 μg)的皮下注射，治疗结束6周后用Fel d1进行支气管激发试验，75 μg和750 μg组PD20 FEV1与基线相比有显著差异，750 μg组血清IL- 4的水平下降。Marcotte等[32]对8例75 μg和7例750 μg治疗患者的T细胞进行体外刺激，发现治疗后肽段特异性T细胞系产生IL- 4量减少，并呈现剂量效应关系。Maguire等[33]通过多中心随机双盲安慰剂对照的研究评价Allervax Cat的有效性，治疗组(75、750 μg)对猫毛耐受明显增强，接受高剂量(750 μg/次)皮下注射的个体在治疗3周后肺功能得到显著改善。但Simons等[34]研究显示，治疗组接受4次250 μg Allervax Cat治疗后，猫毛诱发的皮肤速发和迟发反应并未减轻，且治疗后外周血单个核细胞分泌IL- 4、IL-10、IFN-γ水平未发生改变，提示肽段免疫治疗并未减轻猫毛诱导的速发和迟发的皮肤反应，且不能诱导猫毛特异性Th1型细胞因子的产生。

尽管在上述研究显示Allervax Cat治疗有效，但治疗相关不良反应发生率较高。Norman等[30]的研究发现，750 μg治疗组的患者中，16例(67%)在第一次注射后出现了迟发型哮喘样反应(late-asthmatic reactions，LAR)。同样，Maguire等[33]的研究发现，750 μg治疗组患者，44例(83%)出现了不同程度的不良反应，其中30例(56%)表现为LAR，9例(17%)出现了全身严重不良反应，不良反应的发生率随着注射次数的增多而降低。Simons等[34]等研究显示，250 μg治疗组中有16例(76%)出现了鼻炎、哮喘和皮肤瘙痒等不良反应。

第二种猫毛肽段免疫治疗的疫苗是包含Fel d1 T细胞表位的11～12个重叠肽段的混合物[35- 41]。Oldfield等[35]对24例猫毛过敏的哮喘患者皮内注射不同剂量(1、2.5、5 μg)的疫苗，8例患者接受单次5 μg治疗2周后，皮下注射猫毛全变应原提取液，皮肤迟发反应明显减轻，而速发反应无明显改善，皮肤反应的改善与特异性T细胞增殖的减少和Th1、Th2型细胞因子释放减少相关。该课题组随后对这24例患者进行了一项双盲安慰剂对照的临床研究[36]，其中治疗组16例，对照组8例，治疗组每3～4 d接受1次递增剂量的肽段治疗，共4次(5、10、15、20 μg)，治疗结束后4～8周和3～9个月分别进行随访。在两个随访阶段，治疗组对猫毛和Fel d1 的皮肤迟发反应均明显减轻，在第二个随访阶段，治疗组皮肤对Fel d1速发反应明显减轻，但对猫毛的速发反应没有明显改善。体外试验显示，治疗组3～9个月后外周特异性外周血单个核细胞增殖与基线组相比明显减弱，IL- 4、IL-13、IFN-γ水平降低，同时调节性细胞因子IL-10分泌增多。治疗过程中未发生急性的治疗相关不良事件，4例患者在第一次注射后出现了LAR，再次注射后该不良反应消失。Alexander等[38]的研究中，患者每两周接受一次递增剂量的皮下注射(0.1、1、5、10、25 μg)，治疗结束后气道反应性降低，皮肤迟发型反应受到抑制，这可能与皮肤中的CD4+IFN-γ+T细胞与CD4+CD25+T细胞增多相关。

与Allervax Cat相比，第二种疫苗治疗过程中不良反应发生率降低，LAR最为常见，未发生急性的治疗相关不良事件。Oldfield等[35]研究中，4例(25%)在第一次注射后出现了LAR，再次注射后未发生LAR。Alexander等[38]研究中患者并未出现LAR，可能是与该研究免疫治疗的起始治疗剂量较低有关。

第三种猫毛肽段免疫治疗疫苗为包含有Fel d1 7个 T细胞表位的肽段疫苗(Toleranceomune Cat®)。Patel等[42]评价了该疫苗的治疗有效性，研究显示接受4次6 nmol该疫苗治疗后的效果优于接受8次3 nmol治疗。Haselden等[41]通过36例猫毛过敏的个体通过皮内注射或者皮下注射不同剂量(0.3～20 nmol)的肽段疫苗来评价其安全性。结果显示患者对该疫苗耐受良好，无严重过敏反应发生。皮内注射3 nmol的疫苗能最大程度抑制皮肤迟发反应。

Api m1 T细胞表位治疗蜂毒过敏的安全性与有效性评价

目前仅有3项研究关注蜂毒过敏的个体肽段免疫治疗。3项研究均为小样本，且不是双盲安慰剂对照研究，但目前的数据支持Api m1 T细胞表位治疗蜂毒过敏患者的有效性。1993年，Carballido等[43]鉴定出了蜂毒过敏的主要致敏蛋白Api m1优势T细胞表位。Müller等[44]用PLA2 3个T细胞表位的混合物(氨基酸45～62、82～92、113～124)皮下注射治疗5例蜂毒过敏的患者，患者每周接受1次递增剂量的皮下注射，初始剂量为0.1 μg，维持剂量为100 μg，总剂量为397.1 μg，治疗结束1周后5例患者对皮下注射10 μg磷脂酶A能耐受，2周后有3例能耐受，其他2例发生了轻度的局部不良反应。体外试验显示，3例治疗成功患者的外周血单个核细胞的磷脂酶A和肽段增殖反应均受到抑制，Th2型(IL- 4、IL-5、IL-13)和Th1型(INF-γ、IL-2)的细胞因子水平均下降，肽段治疗60 d后特异性IgE和IgG4的水平均有不同程度的下降。

Texier等[45]研究发现Api m1(氨基酸81～97)含有多个HLA分子结合的活性区域，能与不同的HLA-DR分子结合，可以作为免疫治疗的候选肽段，它也是Müller等[44]用于治疗的三条肽段之一。Tarzi等[46]用此肽段治疗重度蜂毒过敏的患者，12例蜜蜂蜂毒过敏的患者接受9次皮下免疫治疗，治疗组蜂毒和PLA2激发后皮肤迟发型反应明显减弱，PLA2刺激后外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)增殖减弱，IL-13、IFN-γ分泌减少，产生IL-10的水平增加。

Fellrath等[47]对蜂毒过敏的患者采用快速脱敏治疗的方式，治疗应用3段长的合成肽段覆盖了Api m1的全序列。初始剂量为0.1 μg，受试者每30 min接受增量为250 μg的治疗。在免疫治疗的第4、7、14、42和70天接受维持剂量为100 μg或300 μg的治疗，抗原特异性T细胞的增殖增多，同时还有IFN-γ和IL-10水平增多，但是Th2细胞因子未发现。

小　　结

包含变应原致敏组分的T细胞表位短合成肽段能够降低抗原特异性IgE桥联，因此基于T细胞表位的肽段免疫治疗是一种可降低变应原抗原性的治疗手段，这种低变应原性使免疫治疗安全性增加。肽段特异性免疫治疗诱导产生了一群调节性T细胞或抑制性T细胞，从而调节了很多抗原暴露的症状，如：变应原激发后皮肤反应，非特异性气道高反应性，症状积分，生活质量和对自然变应原暴露的耐受。

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