SPE技术在风湿骨痛片麻黄含量测定中的应用

岳　超，张文婷，高　杰，黄琴伟，施　贝，郭增喜*

(1.浙江中医药大学，杭州　310053；2.浙江省食品药品检验研究院，杭州　310004)



SPE技术在风湿骨痛片麻黄含量测定中的应用

岳超1，张文婷2，高杰1，黄琴伟2，施贝2，郭增喜2*

(1.浙江中医药大学，杭州310053；2.浙江省食品药品检验研究院，杭州310004)

摘要：目的采用SPE-HPLC联用技术测定风湿骨痛片麻黄中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量。方法采用Oasis MCX-SPE阳离子固相萃取小柱对样品进行前处理，Welch XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以乙腈-0.1 mL·L-1磷酸(用三乙胺调pH值至3.0)(5∶95)为流动相等度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长207 nm，柱温30 ℃。结果该实验条件下，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱分离度好。盐酸麻黄碱进样量在22.99～1 150 ng、盐酸伪麻黄碱进样量在14.60～730.2 ng范围内线性关系良好，盐酸麻黄碱平均回收率为100.8%(RSD=2.8%)，盐酸伪麻黄碱平均回收率为98.6%(RSD=2.4%)。结论该方法简便、专属性好，能有效消除复方中其他干扰，可用于风湿骨痛片中麻黄的质量控制。

关键词：风湿骨痛片；盐酸麻黄碱；盐酸伪麻黄碱；SPE-HPLC；含量测定

风湿骨痛片具有温经散寒、通络止痛之功，用于寒湿闭阻经络所致的痹病，症见腰脊疼痛、四肢关节冷痛。制剂由制川乌、制草乌、红花、甘草、木瓜、乌梅、麻黄组成，制剂中麻黄发汗宣痹。现代药理研究表明，麻黄碱可兴奋中枢神经系统，通过选择性激动受体而拮抗高K+去极化引起的大鼠膈肌麻痹[1]，配伍君药乌头可以增强散湿止痛之功。盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱是麻黄的主要成分，二者均为肾上腺素类药物，具有使外周血管收缩、血压升高、心跳加快等作用，对高血压、冠心病患者产生不良影响[2-3]，是国家规定需要严格控制的毒、麻类成分。目前测定盐酸麻黄碱的常见方法有滴定法、薄层扫描法、高效液相色谱法等，依据目前研究报道可见，最为常用的测定方法为HPLC法[4-6]。从现有文献报道中可见，盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱在色谱中均为末端紫外吸收，且风湿骨痛片制剂成分复杂，制剂中同极性成分及辅料对麻黄含量测定的干扰较大，使其含量测定较为困难。目前固相萃取(SPE)技术越来越多地应用于中药质量控制[7]，固相萃取技术可以选择性地净化和富集待测的某些组分，与传统的液液萃取相比，SPE技术在组分繁杂、分离纯化和成分分析难度较大的中成药质量控制中更有优势。综上所述，实验采用SPE-HPLC联用技术，有效地消除了制剂中其他成分的干扰，并优化测定方法，改善其灵敏度和专属性，准确地测定麻黄中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量，为风湿骨痛片的质量控制提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器Agilent 1260系列高效液相色谱仪(G1312B 1260四元泵，G1329B 1260自动进样仪，G1316A 1260柱温箱，G4212B 1260DAD检测器，Chemstation色谱工作站)；PA2251电子分析天平(德国赛多利斯)；4020P超声波清洗器(韩国JAC公司)。

1.2试药盐酸麻黄碱对照品(批号：171241-201007，质量分数99.7%)和盐酸伪麻黄碱对照品(批号171237-201208，质量分数99.9%)均由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯；水为MILIQ水；其他试剂均为分析纯。10批风湿骨痛片样品由合肥迪尔医药生物工程有限公司和安徽精方药业股份有限公司提供；缺麻黄样品由合肥迪尔医药生物工程有限公司提供。

2方法与结果

2.1色谱条件Welch XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以乙腈-0.1 mL·L-1磷酸(用三乙胺调pH值至3.0)(5∶95)为流动相等度洗脱，流速1.0 m·min-1，柱温30 ℃，检测波长为207 nm，进样10 μL，理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于4 000。

2.2对照品溶液的制备取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含22.99和14.60 μg的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备取本品20片，精密称定，研细，取2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入0.1 mol·L-1盐酸溶液25 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率400 W，频率40 kHz)40 min,并时时振摇，放冷，称定质量，用0.1 mol·L-1的盐酸溶液补足减失的质量，摇匀，离心，精密量取上清液10 mL，加在SPE柱上(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150或200 mg，容量为6 mL，预先依次用乙腈、水各6 mL淋洗，备用)，依次以水3 mL、氨溶液(5→100)5 mL、水5 mL、甲醇5 mL、乙腈5 mL洗脱，待洗脱液流尽后，放置5 min，用乙腈-浓氨试液(90∶10)混合溶液10 mL洗脱，收集洗脱液，置于40 ℃下减压回收至干，加入流动相3 mL使完全溶解，精密吸取1 mL，置于10 mL量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.4线性关系考察分别精密吸取2.2项下对照品混合溶液1，2，5，10，15，30和50 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，以色谱峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，计算回归方程。盐酸麻黄碱的线性方程为Y=2.304 14X+6.059 8(r=1.000 0)；盐酸伪麻黄碱的线性方程为Y=2.378 4X-0.058 5(r=1.000 0)。结果表明，盐酸麻黄碱在进样量22.99～1 150 ng范围内，盐酸伪麻黄碱在进样量14.60～730.2 ng范围内均有良好的线性关系。

2.5缺味实验取缺麻黄阴性样品和风湿骨痛片样品(批号130602)，按照2.3项下方法制备，并按照2.1项下色谱条件测定，缺麻黄样品溶液在盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品峰处均未出现色谱峰。结果表明，该方法专属性良好。见图1。

图1HPLC图

A.混合对照品；B.供试品溶液；C.阴性样品；1.盐酸麻黄碱；2.盐酸伪麻黄碱

Fig.1 HPLC chromatograms

A.control substance；B.sample；C.negative sample；1.ephedrine hydrochloride；2.pseudoephedrine hydrochloride

2.6精密度实验精密吸取2.2项下对照品混合溶液连续进样6次，记录峰面积。结果显示，盐酸麻黄碱峰面积的RSD为1.1%，盐酸伪麻黄碱峰面积的RSD为0.9%，结果表明，仪器进样精密度良好。

2.7重复性实验分别取供试品(批号130602)6份，按照2.3项下制备方法制备，并按照2.1项下色谱条件测定，结果表明，盐酸麻黄碱平均含量为0.814 mg·g-1(RSD=0.8%)，盐酸伪麻黄碱平均含量为0.323 mg·g-1(RSD=2.2%)，结果表明，该方法重复性良好。

2.8稳定性实验吸取供试品溶液(批号130602)和对照品溶液，分别于0，4，8，12和24 h进样，结果显示，盐酸麻黄碱峰面积对照品溶液RSD为0.1%，供试品溶液RSD为0.9%；盐酸伪麻黄碱峰面积对照品溶液RSD为0.7%，供试品溶液RSD为0.9%。结果表明，供试品溶液和对照品溶液在24 h内基本稳定。

2.9加样回收率实验精密称取供试品(批号130602)9份，分别精密加入盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品溶液适量，按照2.3项下制备法制备，并依照2.1项下方法测定，结果见表1。盐酸麻黄碱平均回收率为100.8%(RSD=2.8%)，盐酸伪麻黄碱平均回收率为98.6%(RSD=2.4%)。

2.10样品测定取10批风湿骨痛片样品，按照2.3项下制备方法制备，并依照2.1项下方法测定，计算含量结果，见表2。

表1风湿骨痛片麻黄加样回收实验结果

Tab.1 Experiment results of recovery rate of Fengshigutong Tablets

成分取样量/g原有量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%盐酸麻黄碱1.00980.82200.50591.318498.12100.82.81.01290.82450.50591.3557105.001.00920.82150.50591.313897.311.02100.83111.01171.8688102.571.00120.81501.01171.815598.901.01730.82811.01171.8703103.021.00040.81431.51762.314798.871.00740.82001.51762.327199.311.03010.83851.51762.4119103.67盐酸伪麻黄碱1.00980.32620.23730.559798.3998.62.41.01290.32720.23730.5664100.811.00920.32600.23730.554996.441.02100.32980.43460.764099.901.00120.32340.43460.7620100.911.01730.32860.43460.744995.791.00040.32310.71191.031399.481.00740.32540.71191.0441100.951.03010.33270.71191.009795.10

表2盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量测定结果

Tab.2 Experiment results of the content determination of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride

批号盐酸麻黄碱/mg·片-1盐酸伪麻黄碱/mg·片-1总量/mg·片-113011040.3050.1120.41713011050.3110.1180.42913011060.3050.1120.41713041020.2970.1100.40813041030.2090.1190.3281004010.3210.1270.4481007010.2190.0950.3141301010.3150.1290.4441306010.3180.1130.4311306020.2940.0990.393

3讨论

3.1供试品制备方法的选择实验中制剂成分复杂，超声处理后存在较多弱极性生物碱类成分，会对麻黄类生物碱的含量测定产生较大影响，实验选择SPE柱对样品进行净化和富集，大大减少杂质的影响。实验对比不同提取方式(超声，回流)、不同超声时间(0，20和40 min)、不同取样量(1.5，2.0和2.5 g)条件下待测成分的含量。结果表明，超声、回流提取效果相当，超声40和60 min提取效率相当，说明40 min时已提取完全，取样2.0 g溶剂量合适，最终确定最佳供试品提取方法。

3.2实验耐用性考察实验选择Kromasil SB 100 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Welch Material XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)2种色谱柱对样品进行测定，2种色谱柱所测得的样品含量偏差在3.0%以内，且2种色谱柱都有较好的分离度；实验分别采用25，30，35和40 ℃的柱温对样品进行测定，不同柱温下均有较好的分离，2种色谱柱所测得的样品含量RSD在3.0%以内。

3.3SPE方案优化实验优化了SPE柱前处理、上样、淋洗、洗脱多个操作及相应溶剂。实验采用水、甲醇、乙腈淋洗，保证目标成分充分交换和完全洗脱；选择乙腈-浓氨(9∶1)溶液洗脱，在既保证目标成分完全洗脱的前提下，又可以减少其他弱极性成分的吸附，达到最佳萃取效果。

综上所述，实验采用SPE-HPLC联合技术，以阳离子SPE技术消除相同极性成分干扰，并优化了液相条件，使得盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的色谱峰分离度好、灵敏度高，可以准确地测定风湿骨痛片中麻黄的含量，为其质量控制提供依据。

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Application of SPE on the content determination ofEphedraeherbain Fengshigutong Tablets

YUE Chao1，ZHANG Wenting2，GAO Jie1，HUANG Qinwei2，SHI Bei2，GUO Zengxi2*(1.Zhejiang Medical University，Hangzhou 310053，China；2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310004，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the content determination of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride in Fengshigutong Tablets by SPE-HPLC. MethodsSamples were pretreated by Oasis MCX-SPE cation solid phase extraction column and analyzed by HPLC consisting of a Welch XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) column and a mixture of acetonitrile-0.1 mL·L-1H3PO4(adjusting the pH to 3.0 with triethylamine) (5∶95) solution as the mobile phase， flow rate was 1.0 mL·min-1and wavelength was 207 nm. The column temperature was 30 ℃. ResultsThe method showed good linearity in the range of 22.99-1 150 ng and 14.60-730.2 ng. The average recovery of ephedrine hydrochloride was 100.8%(RSD=2.8%)，pseudoephedrine hydrochloride 98.6%(RSD=2.4%). ConclusionThis method can eliminate the negative interference，with good specificity，and can be used for the quality control of Fengshigutong Tablets.

Key words:Fengshigutong Tablets；ephedrine hydrochloride；pseudoephedrine hydrochloride；SPE-HPLC；content determination

收稿日期：(2015-04-27)

通信作者：*郭增喜，男，副主任中药师

作者简介：岳超，女，在读硕士研究生

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)01-0045-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.015