线粒体功能障碍在晚期糖基化终产物致肾小球内皮细胞通透性增加中的作用机制

作者单位：510630 广州，中山大学附属第三医院肾内科

线粒体功能障碍在晚期糖基化终产物致肾小球内皮细胞通透性增加中的作用机制

唐骅李灿明赖渭妍饶嘉玲叶增纯娄探奇

【摘要】目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)对大鼠肾小球内皮细胞(rGEnC)通透性的影响及线粒体功能障碍在其中的作用。方法采用原代培养的rGEnC，予AGEs 80 mg/L作用24 h，采用跨内皮细胞电阻抗和异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白滤过率观察通透性的变化，MitoSOX试剂盒检测细胞内活性氧，JC-1荧光标记法检测线粒体膜电位(△Ψm)，荧光素酶检测系统测定三磷酸腺苷(ATP)的生成，蛋白免疫印迹法检测NF-E2相关因子2(Nrf2)的表达。结果AGEs可引起rGEnC通透性升高，活性氧产生增加，采用叔丁基对苯二酚(tBHQ)(20 μmol/L)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)(10 mmol/L)和抗AGE受体抗体(100 mg/L)预处理后，上述AGEs作用被抑制。AGEs可引起rGEnC △Ψm下降，ATP和Nrf2减少，而anti-RAGE抗体可抑制△Ψm下降和ATP减少，tBHQ则能抑制△Ψm下降和Nrf2减少。结论AGEs可导致rGEnC线粒体功能障碍，引起活性氧产生增加，从而导致rGEnC间通透性增加。

【关键词】晚期糖基化终产物；线粒体；肾小球内皮细胞；氧化应激

DOI：10.3969/g.issn.0253-9802.2015.03.003

基金项目：广东省医学科研基金(A2011186)

通讯作者，娄探奇，E-mail：Lou.tq@163.com

收稿日期：(2014-12-18)

Role of mitochondrial dysfunction in advanced glycation end products-induced permeability increases in glomerular endothelial cellsTangHua,LiCanming,LaiWeiyan,RaoJialing,YeZengchun,LouTanqi.DepartmentofNephrology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

Correspondingauthor,LouTanqi,E-mail：Lou.tq@163.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of advanced glycation end products (AGEs) on the permeability of glomerular endothelial cells (rGEnC) in rats and the role of mitochondrial dysfunction in this pathological process. MethodsPrimary cultured rGEnC were incubated with AGEs (80 mg/L) for 24 h. The changes in endothelial permeability were investigated by transendothelial electrical resistance and the flux of fluorescein isothiocyanate-conjugated bovine serum albumin. MitoSOX kit was used to detect intracellular reactive oxygen species (ROS). Mitochondrial membrane potential (△Ψm) was measured by JC1 fluorescein staining. The generation of adenosine triphosphate (ATP) was evaluated by luciferase assay system. The expression of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) was detected by western blotting. ResultsThe monolayer permeability and the generation of ROS of rGEnC were increased by AGEs. Pretreatment with tert-Butyl-hydroquinone (tBHQ) (20 μmol/L), N-acetylcysteine (NAC) (10 mmol/L) and anti-RAGE antibody (100 mg/L) could suppress the detrimental effect of AGEs. The decline of △Ψm, ATP and Nrf2 were induced by AGEs, whereas the decreases of △Ψm and ATP could be blocked by pretreatment with anti-RAGE antibody and the decline of △Ψm and Nrf2 inhibited by tBHQ pretreatment. ConclusionsAGEs can cause mitochondrial dysfunction, leading to elevated levels of ROS, which contributes to increase of permeability in rGEnC.

【Key words】Advanced glycation end products; Mitochondria; Glomerular endothelial cells;

Oxidative stress

作为肾小球滤过膜的第一道屏障，肾小球内皮细胞(GEnC)在糖尿病肾病发病和蛋白尿产生中的作用日益受到重视[1]。目前研究证实，糖尿病肾病时GEnC存在着线粒体功能障碍，可能是导致内皮细胞损伤，引致肾小球滤过屏障通透性增高的机制之一[2-4]。笔者前期研究初步发现，晚期糖基化终产物(AGEs)可导致GEnC活性氧产生增多，而且下调细胞内重要的抗氧化蛋白NF-E2相关因子2(Nrf2)的表达，最终导致GEnC之间的通透性增加，但线粒体功能障碍是否参与了GEnC损伤的过程，目前仍不清楚。为此，本研究观察了AGEs对大鼠GEnC(rGEnC)通透性的影响及线粒体功能障碍在其中的作用，现报告如下。

材料与方法

一、 细胞培养

原代培养的rGEnC受赠于美国西北大学Dr. Stephen Adler。rGEnC采用含有10%胎牛血清(美国Gibco)，10%NuSerum血清替代品(美国BD)、100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基(美国Gibco)培养。使用4～8代细胞进行试验。

二、 实验分组

将细胞分为5组：①对照组(Control组)，内皮细胞在不加任何刺激的RPMI1640培养基中培养；②AGEs组，内皮细胞与80 mg/L AGEs(德国Merck)培养24 h；③AGEs+叔丁基对苯二酚(tBHQ)组(AGEs+tBHQ组)，20 μmol/L tBHQ(美国Sigma)预处理内皮细胞4 h，然后加入80 mg/L AGEs；④AGEs+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组(AGEs+NAC组)，10 mmol/L NAC(美国Sigma)预处理内皮细胞4 h，然后加入80 mg/L AGEs；⑤AGEs+抗RAGE抗体组(AGEs+anti-RAGE组)，100 mg/L anti-RAGE(美国Sigma)预处理内皮细胞1 h，然后加入80 mg/L AGEs。其中tBHQ为Nrf2的激动剂，NAC是抗氧化剂，anti-RAGE为AGEs受体的中和性抗体。

三、 跨内皮细胞电阻的检测

单层细胞电阻抗采用Millicell-Electrical Resistance System(美国Millipore)检测。rGEnC生长于Transwell filter(美国Corning)上，检测时电极上下极均浸泡在培养基中，电阻抗由浸入培养基中的探头检测，直至3次读数相近则记录数值。上下极之间的差值用于计算电阻抗值(Ω/cm2)。

四、 含异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白滤过率

rGEnC生长于Transwell filter上，待生长成为致密连接状态后，上室换为含异硫氰酸荧光素标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA，美国Sigma)的培养基，下室换为含未标记的BSA培养基。加处理因素后，从上下室各收集液体200 μl，放于96孔板中(黑色)。采用多功能读板机(美国Molecular Devices)，测定收集液体在492 nm波长处荧光吸光度值，计算收集液FITC-BSA浓度。通过以下公式计算滤过率：滤过率=C下室×V下室/(C上室×V上室)，C为FITC-BSA浓度，V为液体体积。

五、 细胞线粒体内活性氧的检测

细胞线粒体内活性氧的生成量采用MitoSOX法(美国Invitrogen)检测。细胞接种于培养皿，加入终浓度5 μmol/L MitoSOX，37 ℃避光孵育10 min，洗涤后，加入DNA染料Hoechst。利用激光共聚焦显微镜检测MitoSOX荧光强度变化。每份样品检测30个细胞，激发波长514 nm，发射波长580 nm，所有样品拍摄条件固定不变。

六、 线粒体膜电位测定

采用JC-1荧光标记法(美国Molecular Probes)测定。在细胞悬浮液中加入JC-1，使其达所需终浓度，37℃孵育15 min后，磷酸盐缓冲液清洗2次，流式细胞仪测定荧光值。

七、 细胞ATP生成测定

采用荧光素酶检测系统(美国Promega)测定。按照试剂盒步骤，采用1%三氯乙酸提取细胞ATP后，加入TRIS-醋酸盐调整pH至7.75。在细胞裂解液中加入荧光素酶试剂。光度计测定荧光强度。

八、 蛋白免疫印迹

提取总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜，封闭，分别加入抗Nrf2抗体(1∶500，美国Santa Cruz Biotechnology)，抗GAPDH抗体(1∶10 000，美国Protein Tech Group)，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(1∶40 000)，曝光，显片。

九、 统计学处理

结果

一、 AGEs对rGEnC通透性的影响

AGEs可引起单层rGEnC的电阻下降(tAGEs/Control=28.00，P<0.001)，同时，FITC-BSA滤过率在AGEs作用后增加(与对照组比较，t=21.59，P<0.01)，提示AGEs可使单层rGEnC的通透性升高。予tBHQ、NAC和anti-RAGE抗体预处理后，AGEs升高rGEnC通透性的作用被阻断(电阻：tAGEs+tBHQ/AGEs=8.000、tAGEs+tNAC/AGEs=5.231、tAGEs+anti-RAGE抗体/AGEs=13.99；滤过率：tAGEs+tBHQ/AGEs=8.982、tAGEs+tNAC/AGEs=7.131、tAGEs+anti-RAGE抗体/AGEs=18.48；P均<0.01)，见图1。

图1AGEs对rGEnC通透性的影响(n=3)

A：跨内皮细胞电阻；B：FITC-BSA 滤过率；与Control组比较，*P<0.01；与AGEs组比较，#P<0.01

二、 AGEs对rGEnC活性氧产生的影响

AGEs可升高rGEnC的活性氧水平；予tBHQ、NAC和anti-RAGE抗体预处理后，AGEs导致活性氧生成增加被抑制，见图2。

图2AGEs对rGEnC活性氧产生的影响(免疫荧光，×1 000)

A：Control组；B：AGEs组；C：AGEs+tBHQ组；D：AGEs+NAC组；E：AGEs+anti-RAGE抗体组

三、 AGEs对rGEnC线粒体膜电位的影响

AGEs可导致rGEnC线粒体膜电位下降(tAGEs/Control=12.31，P<0.01)；予tBHQ和anti-RAGE抗体预处理后，可减轻AGEs引起的rGEnC线粒体膜电位下降(tAGEs+tBHQ/AGEs=5.651、tAGEs+anti-RAGE抗体/AGEs=9.042，P均<0.01)，见图3。

图3AGEs对rGEnC线粒体膜电位的影响(n=3)

与Control组比较，*P<0.01；与AGEs组比较，#P<0.01

四、 AGEs对rGEnC ATP生成的影响

AGEs可引起rGEnC ATP生成减少(tAGEs/Control=14.72，P<0.01)。予anti-RAGE抗体预处理后，ATP的生成减少被抑制(tanti-RAGE抗体/AGEs=10.78，P<0.01)；而予tBHQ预处理后，AGEs引起的ATP减少未能被抑制(tAGEs+tBHQ/AGEs=0.646，P>0.05)，见图4。

图4AGEs对rGEnC ATP生成的影响(n=3)

与Control组比较，*P<0.01；与AGEs组比较，#P<0.01

五、 AGEs对rGEnC Nrf2的影响

AGEs组Nrf2表达低于Control组(t=9.232，P<0.01)；AGEs+tBHQ组rGEnC Nrf2表达高于AGEs组(t=5.273，P<0.01)，见图5。

图5AGEs对rGEnC Nrf2的影响(n=3)

与Control组比较，*P<0.01；与AGEs组比较，#P<0.01

讨论

糖尿病肾病是由糖尿病所导致的肾损害，不积极治疗的糖尿病肾病最终进展为ESRD。糖尿病肾病的发病机制尚未阐明，目前相关研究以糖尿病和高血压病所致的肾小球高灌注和过度滤过以及高血糖所致的蛋白非酶糖化和AGEs的生成为热点[5]。

GEnC为一薄层扁平细胞，细胞体满布窗孔，可拦阻血液中血细胞等有形成分，选择性地截留中到大分子物质，在防止蛋白尿产生中起着重要作用[6-7]。笔者前期研究发现，AGEs可以增加GEnC之间的通透性，可能是糖尿病肾病时引起内皮细胞功能障碍，进而导致肾小球滤过屏障损害和蛋白尿增加的原因[8]。

线粒体是细胞有氧代谢的枢纽，通过氧化磷酸化产生能量，满足代谢需要，是细胞的动力工厂[9]。一旦线粒体功能出现障碍，ATP产生减少和活性氧产生增多，都可能导致GEnC结构和功能的损伤，破坏内皮细胞之间的连接结构，导致通透性增加[4, 9]。线粒体功能障碍可能是GEnC损伤的早期事件[10]。目前有研究发现，GEnC线粒体功能障碍引起的氧化应激增加，甚至可导致足细胞损伤[3]。但线粒体功能障碍是否参与了GEnC损伤的过程，目前仍不清楚。

本研究发现，AGEs可以引起单层rGEnC电阻下降、滤过率增加，同时细胞活性氧产生增加，线粒体膜电位下降， ATP的生成减少，rGEnC之间的通透性增加。当使用Nrf2激动剂tBHQ或者是活性氧清除剂NAC，可以明显阻断AGEs升高rGEnC通透性的作用，活性氧的生成被抑制，线粒体膜电位下降，抗氧化蛋白Nrf2明显增加，从而逆转AGEs对rGEnC线粒体功能的影响。应用AGEs受体的中和性抗体anti-RAGE后也可得到类似的结果，且其可明显增加被AGEs抑制的ATP生成。研究结果提示，减少氧化应激的损伤，可能是保护GEnC功能的有效途径之一，但这是否能作为糖尿病肾病的药物治疗靶点，尚需要进一步的研究证实。

综上所述，糖尿病肾病时体内升高的AGEs可能会导致GEnC线粒体功能障碍，引起活性氧产生增加，从而导致细胞间通透性增加，这可能是糖尿病肾病时蛋白尿生成的机制之一。

参考文献

[1]Cheng H, Harris RC. Renal endothelial dysfunction in diabetic nephropathy. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2014,14:22-33.

[2]Wang W, Wang Y, Long J, et al. Mitochondrial fission triggered by hyperglycemia is mediated by ROCK1 activation in podocytes and endothelial cells. Cell Metab,2012,15:186-200.

[3]Daehn I, Casalena G, Zhang T, et al. Endothelial mitochondrial oxidative stress determines podocyte depletion in segmental glomerulosclerosis. J Clin Invest,2014,124:1608-1621.

[4]Reidy K, Kang HM, Hostetter T, et al. Molecular mechanisms of diabetic kidney disease. J Clin Invest,2014,124:2333-2340.

[5]杨念生，肖海鹏. 糖尿病肾病诊治新进展——内分泌代谢疾病(9). 新医学，2004，35：117-119.

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[7]Haraldsson B, Nystrom J. The glomerular endothelium: new insights on function and structure. Curr Opin Nephrol Hypertens,2012,21:258-263.

[8]李灿明，叶增纯，彭晖，等. 肾素血管紧张素系统在晚期糖基化终产物改变肾小球内皮细胞通透性中的作用. 中华肾脏病杂志,2011,27:667-672.

[9]Joshi M, Kotha SR, Malireddy S, et al. Conundrum of pathogenesis of diabetic cardiomyopathy: role of vascular endothelial dysfunction, reactive oxygen species, and mitochondria. Mol Cell Biochem, 2014,386:233-249.

[10]Sawant DA, Wilson RL, Tharakan B, et al. Tumor necrosis factor-α-induced microvascular endothelial cell hyperpermeability: role of intrinsic apoptotic signaling. J Physiol Biochem,2014，70:971-980.

(本文编辑：林燕薇)

临床研究论著