基于正交试验的向日葵种子蛋白双向电泳技术的研究

张晓倩， 刘 洋， 吕 潇， 杨仁杰， 李梦婷， 刘海学

（1.天津农学院农学与资源环境学院， 天津300384； 2.天津农学院工程技术学院， 天津300384）

向日葵（H.annuus L.），别名太阳花，是菊科向日葵属的植物。在16世纪末或17世纪初传入我国，主产区分布在东北、西北和华北地区，如内蒙古、吉林、辽宁、黑龙江、山西省等。向日葵的种子含油量极高（48%～55%），是重要的油料作物，也被誉为世界第三大油料作物。向日葵种子中含有球蛋白、清蛋白和油脂体蛋白等丰富的蛋白质，是优质食用油和优质蛋白质的重要来源之一［1］。向日葵作为植物油脂和蛋白质的重要来源，在有效供给油脂和蛋白质、改善食物结构、促进养殖业和加工业发展等方面起重要作用［2］。蛋白质双向电泳技术，是一种检测和分析蛋白质的生化手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术［3］，但探究出一套能够分离不同种植物种子间的差异蛋白的双向电泳体系，仍是当今需要解决的难题。本实验通过正交设计，对影响向日葵蛋白质双向电泳技术中的3个关键因素进行了探讨，以期为今后向日葵蛋白质组学的研究奠定基础，也为其它油类植物蛋白质组学的研究提供新思路。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为天津农学院农业分析测试中心保存干燥的向日葵种子。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白的提取

蛋白的提取方法有很多种，如改良水提取法和有机溶剂提取法［4］、三氯乙酸／丙酮沉淀法和酚提取法［5］等，但根据文献和反复试验表明，这些方法都存在样品用量大、提取杂质较多、溶解非常困难等问题。为了克服这些弊端，向日葵种子蛋白提取采用的是上海生物化工科技发展有限公司（简称上海生工）植物蛋白提取试剂盒。具体步骤是：取干燥的向日葵种子剥去皮，用刀切取种子尖端约3mm（100mg），放入研钵中，加入适量液氮迅速研碎，然后按试剂盒操作说明进行操作，最后加入700μL提前配置好的裂解液，漩涡震荡使沉淀悬浮，－20℃过夜溶解。

1.2.2 蛋白定量

使用Thermo公司生产的超微量核酸蛋白检测仪，采用紫外吸收A280法进行蛋白定量，观测结果。试样重复测定3次，最后取平均值。

1.2.3 水 化

将样品取出解冻后，4℃，16 000r／min，离心5min，备用。参照GE说明书，采用18cm长的IPG胶条，水化液体积为350μL。按表1所示，依次加入样品和所需试剂至离心管中，混匀。然后将水化液加到水化槽中，提前从－20℃冰箱中取出胶条，胶面朝下放入槽中，上面加一层覆盖油，盖好盖子，水平放置12h。

表1 向日葵种子蛋白样品水化表

1.2.4 实验设计

对向日葵种子蛋白分析采用L4（23）正交表进行正交设计，总计安排组织了4次实验。因子水平安排见表2。其中E为胶浓度，F为聚焦时间，G为上样量。正交设计共4个处理，每处理重复3次。向日葵种子蛋白双向电泳完毕后，统计差异蛋白点个数。运用SPSS 19.0软件进行正交设计和方差分析。

表2 L4（23）向日葵种子蛋白正交试验设计

1.2.5 蛋白质双向电泳

第一向固相pH值梯度等电聚焦电泳（IEF）：将水化好的IPG胶条放入IPGphor 3（GE－Healthcare）（垂直电泳测序系统）的电泳槽中，胶面朝上，参照GE公司操作手册［6］进行，设定2个电泳时间，参数设定分别为：20℃、100V（30min）、100～500V 梯度（1h）、500～1 000V 梯度（1h）、1 000～6 000V 梯度（2h）、6 000V 保持（30min），总共一向电泳时间为5h；20℃、100V（30min）、100～500V 梯度（1h）、500～1 000V梯度（1h）、1 000～2 000V 梯度（1h）、2 000～6 000V 梯度（2h），6 000～8 000V 梯度（1.5h），8 000 V保持（30min）总共一向电泳时间为7.5h。

将等电聚焦完成的IPG胶条进行平衡。胶条的平衡分两步进行：第一步用含有1%DTT的平衡液，平衡15min；第二步用含有2.5%碘乙酰胺的平衡液，平衡15min，胶条平衡过程中须在水平摇床上不停摇晃。

第二向SDS－PAGE垂直板电泳：依据设计好的正交试验需要，分别配制厚度为1mm、胶浓度为T＝10%和12.5%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，将平衡好的胶条移入玻璃板中，再用加溴酚蓝的0.5%的琼脂糖溶液封顶。放入 Ettan DALTsix电泳仪（GEHealthcare）进行电泳。电泳开始时，电流设定为10mA／板，待溴酚蓝前沿移动到凝胶上后，加电流加至30mA／板，当溴酚蓝前沿跑至距胶底部0.5～1cm处时，电泳完毕［7］。

1.2.6 凝胶染色

电泳结束后，迅速启胶，将凝胶在水中固定1min，用考马斯亮蓝染液避光染色8～10h后，换为水脱色，脱色至背景无色透明，蛋白点清晰为止。

1.2.7 图像扫描和分析

用Imagescanner型扫描仪进行扫描，调整对比度，观察胶图情况使背景和蛋白点的对比度处于最佳状态，扫描后保存图片。另外，采用ImageMaster－Dplatinum 5.0分析软件进行分析，设置相同的参数条件：光滑度为5，最小区域值为8，显著度为10，先自动检测所有蛋白点，后手动剔除软件错误识别的蛋白点［7］。

2 结果与分析

2.1 向日葵种子差异蛋白正交试验结果

胶浓度、聚胶时间、上样量对向日葵种子差异蛋白的影响试验（图1、图2、图3、图4）结果见表3。方差分析结果（表3）表明：不同胶浓度、不同上样量之间向日葵种子差异蛋白点的数量存在显著的差异（p＜0.05），而聚焦时间对向日葵种子差异蛋白点数量的影响不存在显著差异（p＜0.05）。进一步就胶浓度、上样量对向日葵差异蛋白点的影响进行分析（表4）可知，胶浓度12.5%水平下的向日葵差异蛋白点显著高于10%水平；上样量为3.5mg的向日葵差异蛋白点显著高于2.5mg。由于因素内水平极差（R）的大小能够说明该因素对实验结果的影响程度，由表4经计算便得到参试3因素胶浓度、上样量和聚胶时间的极差分别为32、14、3，因此，对向日葵种子差异蛋白影响的主次关系归纳为E＞G＞F，即依次是胶浓度、上样量和聚胶时间，根据各因素水平的大小，可得到最优水平组合为：E2F1G2。

2.2 上样量对向日葵种子蛋白质双向电泳分辨率的影响

通过比较图1和图3发现，上样量对向日葵蛋白质双向电泳分辨率有明显影响。上样量为2.5mg时（图1），蛋白点虽没有明显拖尾现象，整个凝胶图上的蛋白点多数呈圆形，但蛋白点数明显偏少，只有46个，这就使得一些低丰度的蛋白点很难呈现，而低丰度蛋白点往往是生命活动中起主要作用的功能蛋白。当上样量为3.5mg时（图3），检测出的蛋白点共116个，一些低丰度蛋白点清晰可见，且分布较均匀。因此，向日葵种子双向电泳的上样量以3.5mg左右为宜。

2.3 等电聚焦时间对向日葵种子差异蛋白的影响

由图2可看出，当一向等电聚焦时间为7.5h时，由于样品沉淀时间过长会分解部分蛋白，使蛋白点丢失，况且聚焦过度也会造成蛋白点在凝胶上纵向拖尾，从而影响对蛋白点的整体分析。图3显示，当一向等电聚焦时间为5h，蛋白点能得到较好的分离，蛋白点呈圆形，基本上没有明显拖尾现象，蛋白点数量较多，且均匀的分布在凝胶上。图2和图3的差异蛋白点约为29个，充分说明，双向电泳一向聚焦时间为5h左右为宜。

表3 向日葵种子差异蛋白的L4（23）正交试验方案与结果

图1 上样量2.5mg、一向聚焦时间5h、聚丙烯酰胺凝胶浓度10%凝胶电泳

图2 上样量3.5mg、一向聚焦时间7.5h、聚丙烯酰胺凝胶浓度10%凝胶电泳

图3 上样量3.5mg、一向聚焦时间5h、聚丙烯酰胺凝胶浓度12.5%凝胶

2.4 胶浓度对向日葵种子差异蛋白的影响

从凝胶的扫描图（图1和图3）可看出，10%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白点的范围较小，而12.5%浓度的凝胶分离蛋白点的范围要大很多，大范围的分离凝胶上的蛋白点，可以使差异蛋白点在凝胶上呈现得更显著。

3 讨 论

通过对本实验结果的分析及对蛋白质组学双向电泳技术相关文献的查阅可以看到，蛋白质双向电泳技术是受多种因素影响的多步骤实验。因此，要想得到较高重复性和分辨率的2－DE图谱，必须将电泳过程中的每一个因素都进行优化。

3.1 上样量对2－DE图谱的影响

适宜的上样量不仅会使2－DE图谱的蛋白点清晰，而且也决定了该种植物蛋白质在2－DE图谱上可以很好的表达。本实验发现，若上样量较少，则2－DE图谱上分离得到的蛋白质点较少。其主要原因是水化时进入IPG胶条的蛋白质量较少，从而增加了低丰度蛋白的检测难度；而当蛋白质的上样量高出其最适上样量时，不仅不会增加2－DE图谱上的蛋白点数，反而会比过低的上样量检测出的蛋白点更少。其原因可能是蛋白质上样量过高，在聚焦时容易造成蛋白质在电泳槽中沉淀，不能很好地进入IPG胶条中，进而在2－DE图谱上不能得到较清晰且数量较多的蛋白点［8］，这一点在陈蕊红等［9］的实验中也得到了证实。此外，蛋白质样品中的盐离子含量过高，也会降低2－DE图谱的分辨率，从而表现出蛋白质点过少［9］的现象。

3.2 一向等电聚焦时间对2－DE图谱的影响

适宜的一向等电聚焦时间，可以使不同的蛋白质根据其等电点不同均匀的分布在IPG胶条上。如果一向等电聚焦时间过短，IEF胶条中吸入的蛋白质则不能完全的在IPG胶条中均匀分布，以致在对2－DE图谱处理时得到的蛋白质点较少；而等电聚焦时间过长，则2－DE图谱上又会出现较多的横向条纹，降低了蛋白点分辨率，增加了其检测的难度。除此之外，时间过长还会引起阴极漂移并丢失碱性蛋白，造成水平拖尾［10］。也有学者研究表明，蛋白质样品中的杂质（主要是盐离子）浓度超过100mmol／L时，也会在2－DE图谱中出现大量的横向条纹［11］。本实验也对不同的一向等电聚焦时间作为参变量进行了对比，其中，聚焦时间为7.5h，同样在2－DE图谱中也出现了大量的横、纵条纹，与上述研究者的结果一致，而5h的聚焦时间则明显地减少了横、纵条纹的干扰。本研究还发现，经过7.5h聚焦后的2－DE图谱上蛋白点不是正常的接近于圆形，而是被严重的拉长了许多，原因可能是样品中盐离子浓度过高，导致IPG胶条中溶液电导率增大，从而引起电渗导致电压不能升高，进而影响聚焦效果。因此，在蛋白质双向电泳实验中做一向等电聚焦时必须除盐。

图4 上样量2.5mg、一向聚焦时间7.5h、聚丙烯酰胺凝胶浓度12.5%凝胶

表4 胶浓度、聚胶时间及上样量对向日葵种子蛋白的差异显著性测验

3.3 其 它

在对向日葵种子蛋白进行双向电泳过程中还发现，聚焦电压有时达不到预设值，原因除了蛋白质样品中含大量盐离子之外，还有可能是由于外部环境因素造成。如在夏天高温天气进行等电聚焦，室温和聚焦仪存在很大的温差，导致在聚焦板上凝结出大量水珠形成短路而造成聚焦电压达不到预设值［12，13］。因此在夏天进行双向电泳实验时，必须控制外部温度在20℃左右。

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