农杆菌敏感小麦基因型筛选与转化条件的优化

周济铭， 党政平， 李双勇， 丁 宽， 张小红

（1.杨凌职业技术学院， 陕西 杨凌712100； 2.陕西省富平县种子技术推广中心， 陕西 富平711700；3.西安市长安区农业技术推广中心， 西安710100； 4.西北农林科技大学， 陕西 杨凌712100）

近些年来，转基因技术已经应用在玉米、大豆等作物中并且取得了很大成效，这给小麦的遗传改良带来了希望［1］。目前，在小麦的转基因研究中，基因枪法和农杆菌介导法是最常用的2种基因转化方法，其中基因枪法在实际中应用最多，绝大部分转基因小麦植株是由基因枪法获得的［2］。利用基因枪法转化成本很高，转化率低、操作繁琐［3］，与基因枪法相比，农杆菌介导法费用低廉，操作简单，目的基因的大小基本不受限制，后代中目的基因多以单拷贝的状态存在，能够表达预期的目标性状等［4］。但小麦属于单子叶植物，与双子叶植物相比，农杆菌转化的效率还很低，不同基因型小麦间的转化效率差异很大，不同品种对农杆菌菌侵染时的敏感程度不同，存在较强的基因型依赖性，因此筛选对农杆菌敏感的小麦基因型，优化转化条件，提高农杆菌转化效率，扩大该方法的应用范围，对促进小麦转基因研究有重要意义。

影响小麦农杆菌转化效率的因素有基因型、侵染时菌液浓度和侵染时间等。为了优化转化体系，提高转化效率，前人已进行过相应研究［5－14］，在小麦的农杆菌转化方面取得了很大进展。但由于使用材料、侵染菌株及培养条件等的差异，在实际转化中仍难以大量应用。目前，农杆菌敏感小麦基因型比较匮乏，转化效率低，转化条件仍需进一步改进和优化。本研究主要以不同基因型的冬小麦品种的幼胚愈伤组织为受体材料，通过农杆菌侵染后的GUS基因瞬时表达结果的检测，筛选出对农杆菌敏感的基因型，同时优化农杆菌转化过程中的几个影响因素，为完善小麦农杆菌转化方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 受体材料

新春9号、郑麦9023、济麦19、周麦22等共13个小麦品种的幼胚愈伤组织用于农杆菌敏感基因型的筛选；新春9号的幼胚愈伤组织用于转化条件的优化。

1.1.2 培养基

实验所用的培养基包括LB固体培养基：胰蛋白胨10g／L，酵母提取物 5g／L，NaCl 10g／L，琼脂15g／L，pH＝7.0，高温灭菌20min；YEP液体培养基：胰蛋白胨10g／L，酵母提取物5g／L，NaCl 5g／L，pH＝7.0，高温灭菌20min；愈伤诱导培养基：MS无机盐，1.0mg／L VB1，天门冬酰胺 0.15g／L，2.0mg／L 2，4－D，蔗糖30g／L，植物凝胶2.5g／L，pH＝5.8；侵染液：1／10MS 无机盐，MS 维生素，0.75g／L MgCl2，MES 1.95g／L，麦芽糖40g／L，谷氨酰胺0.5g，CH 0.1 g，葡萄糖10g，Picloram 2.2mg，AS 39mg，Vc 100mg，2，4－D 2.0mg，定容1 000mL，pH＝5.4，过滤除菌。

1.1.3 农杆菌菌株及质粒载体

农杆菌菌株为C 58C1［11］含植物双元表达载体pPNT 290，携带由Ubiquitin启动子调控的GUS基因和由35S启动子调控的NPTⅡ基因，菌株与载体均由中国农业科学院作物所叶兴国老师惠赠。

1.2 实验方法

1.2.1 材料的取样、消毒与接种

小麦开花授粉12～13d后，幼胚大小为1.0～1.2 mm时，于田间收集小麦未成熟籽粒，在超净工作台上加入75%的酒精表面消毒30s，再用0.1%的升汞灭菌处理15min，无菌水冲洗3次，用于幼胚接种。

在超净工作台上，将消毒后的种子用无菌手术刀尖挑出幼胚，盾片向上接种到愈伤诱导培养基上，25℃下暗培养，之后用于农杆菌的侵染。

1.2.2 农杆菌菌株的活化与扩大培养

从－80℃冰箱取出农杆菌菌株，将其划线接种到含有50mg／L 庆大霉素、50mg／L 利福平、50mg／L壮观霉素和50mg／L链霉素的LB固体培养基上，28℃活化培养3d；然后在LB固体培养基上挑取单菌落，接种到含有50mg／L庆大霉素、50mg／L利福平、50mg／L壮观霉素和50mg／L链霉素的5mL YEP液体培养基中，28℃，220r／min摇菌过夜培养。

次日，将过夜培养的5mL菌液倒入50mL YEP（含有相同浓度的上述抗生素）液体培养基中，28℃，240r／min摇菌6～7h，待菌液OD600在0.6～0.8之间时，停止摇菌培养，将菌液3 500r／min离心10min，去上清，收集菌体，用侵染液重悬菌体，摇匀将其稀释到OD600＝0.7，备用。

1.2.3 农杆菌敏感基因型的筛选

小麦幼胚接种到诱导愈伤培养基上25℃暗条件下预培养4d，在将上述重悬菌液（OD600＝0.7）直接加入到固体培养基上，没过材料侵染1h，用无菌滤纸将幼胚上残留的菌液吸干，然后将幼胚转移到无菌滤纸上，25℃黑暗条件下共培养2d后进行GUS染色。

1.2.4 农杆菌转化条件的优化

1）幼胚预培养时间的确定。将新春9号新鲜幼胚放入侵染液中预处理60min，弃去侵染液后加入上述OD600＝0.7的重悬菌液直到没过材料，分别侵染30min和60min，每个侵染时间下进行3次重复；侵染结束用无菌滤纸将幼胚上残留的菌液吸干，将幼胚转接到与侵染液成分相同的固体培养基上，25℃黑暗条件下共培养2d后进行GUS染色。

将新春9号幼胚接种到愈伤诱导培养基上，25℃暗条件预培养4d，侵染与共培养过程同上。

2）适宜菌液浓度的确定。将幼胚接种到愈伤诱导培养基上，预培养7d后，挑选生长良好的愈伤组织放入不同浓度的重悬菌液（OD600＝0.5、1.0、1.5）中侵染30min；每个菌液浓度处理下重复3次。其中对照（ck）是将愈伤组织放入不含有农杆菌菌液的侵染液中处理相同的时间，其余操作均相同。侵染过程中晃动几次，侵染结束后用无菌滤纸将愈伤组织表面残留的菌液吸干，将愈伤放到无菌滤纸上，25℃暗条件下共培养2d后进行GUS染色。

3）适宜侵染时间的确定。对小麦幼胚进行7d的预培养，挑选生长良好的愈伤在OD600＝1.0的重悬农杆菌菌液浓度下侵染15，30，60min；每一个的侵染时间处理下重复3次。对照处理和侵染结束后的处理方法同2）。

1.2.5 GUS表达活性的化学组织染色

采用 X－Gluc染色方法［15］，对转化的材料进行GUS组织化学染色。将侵染后的愈伤放入1.5mL的离心管中加入适量的X－Gluc染液，37℃避光条件下染色24h，染色完毕将染液吸出，用75%乙醇脱色后统计显色愈伤组织数，计算GUS基因的瞬时表达率。

1.3 数据统计分析

GUS基因瞬时表达率（%）＝显色的愈伤数目／用于染色检测的愈伤数×100%。

2 结果与分析

2.1 农杆菌敏感基因型的筛选

将新春9号、郑麦9023、济麦19等13个小麦基因型的幼胚预培养4d，利用含有GUS基因的农杆菌C58 C1进行侵染，共培养2d后进行GUS组织化学染色，统计得到了各基因型幼胚的GUS瞬时表达率（表1）。可以看出，GUS基因的瞬时表达率在0～95.9%之间，各基因型间差异明显。根据GUS基因瞬时表达率可将不同基因型分为对农杆菌侵染敏感型、一般敏感型、低敏感型和不敏感型四类，其中新春9号、小偃328和济麦19三个基因型为敏感型，GUS基因表达率均达到90%以上，其中新春9号最高，为95.9%；其次是西农882、小偃296、周麦27、小偃166和郑麦9023五个小麦基因型，GUS的表达率为20%～40%，对农杆菌为一般敏感型；而周麦22、泛麦5号和济麦22 3个为低敏感型品种，GUS的表达率为5.6%～12.5%；而良星66和西农2611两个基因型对农杆菌不敏感，GUS基因的表达率为0。

表1 不同基因型小麦幼胚愈伤组织GUS基因的瞬时表达情况

2.2 农杆菌转化条件的优化

2.2.1 幼胚预培养对侵染效果的影响

将新春9号剥离的新鲜幼胚分别预培养0d和4d，之后用浓度为OD600＝0.7的重悬菌液分别侵染30min和60min，共培养后经GUS染色统计结果见表2。由表2可以看出，预培养0d的幼胚在侵染30min和60min时的GUS基因表达率均为0，而预培养4d的幼胚在2个侵染时间下的GUS平均瞬时表达均超过了90%，分别为92.0%和95.9%，这说明经过4d预培养的幼胚对农杆菌的敏感性要明显好于新鲜幼胚。

另外，在实验中观察到，预培养4d的幼胚在侵染不同时间下表现出的侵染效果有所差异：侵染60min的幼胚经过染色，染色程度更深，说明GUS基因在愈伤中的表达量更大。

表2 不同预培养时间及不同侵染时间下GUS基因的瞬时表达情况

2.2.2 适宜菌液浓度的确定

新春9号幼胚经过7d的预培养，在菌液浓度OD600＝0.5、1.0、1.5下分别侵染30min，共培养后经GUS染色，结果见表3。结果显示，3个菌液浓度下GUS瞬时表达率都非常高，在菌液浓度OD600为1.0时最高，达到了94.0%。

表3 不同菌液浓度条件下GUS基因瞬时表达结果

2.2.3 适宜侵染时间的确定

将新春9号的幼胚诱导愈伤预培养7d，在菌液浓度 OD600＝1.0菌液浓度下分别侵染15，30，60min，结果见表4。可以看到，在实验的菌液浓度和不同侵染时间下，幼胚愈伤的农杆菌侵染效果均较好，幼胚GUS瞬时表达率均达到了90%以上。但从后期脱菌处理及培养效果来看，应选择较短的侵染时间为好。

表4 不同侵染时间条件下GUS基因瞬时表达结果

3 讨 论

目前来看，利用农杆菌介导法对小麦进行外源基因的转化与基因枪法相比体系还不是很完善，应用范围上也不够广泛，但它是一种非常有发展前景的方法。影响农杆菌转化效率的因素有很多，前人关于这方面的研究报道也较多。本研究从小麦的基因型、外植体的状态、菌液浓度和侵染时间几个方面进行了研究，以期能够进一步优化和完善农杆菌介导的小麦遗传转化体系。

小麦的基因型对于农杆菌介导的转化效果影响很大，实验中所使用的13个小麦基因型进行转化之后GUS的瞬时表达率差异非常显著，最低的为0，最高达到95.9%。在本实验中，筛选到3个对农杆菌敏感的基因型，其幼胚愈伤组织的GUS表达率均远高于叶兴国［11］、石珍源等［16］的研究结果，分析可能是由于试验过程中使用的外植体类型的差异造成的，因此认为，选用生理活性较高的幼胚愈伤对于提高农杆菌转化效果有进一步的促进作用；同时部分相同品种的实验结果存在差异，分析可能和供试品种来源及纯度有关。

利用新鲜幼胚和预培养后的幼胚愈伤组织为受体，结果显示，新鲜的幼胚对于农杆菌的侵染完全不敏感，检测不到GUS基因的表达；而预培养4d的幼胚愈伤组织对于农杆菌的侵染非常敏感，GUS阳性率均达到了90%以上；同时适宜菌液浓度和侵染时间的实验中，预培养7d的幼胚转化效率也非常高。这一结果与前人相关研究结果基本一致。王永勤等研究认为，利用预培养10d以上的幼胚适合做为农杆菌转化的材料［17］。Uze M等研究预培养3～24d幼胚经过农杆菌转化之后GUS的表达率，发现10d以上的预培养比3d的预培养效果要好很多［18］。黄益洪等［14］将幼胚预培养了10～15d，转化后获得了瞬时表达率为60%～80%的材料。这些结果表明，幼胚预培养可以显著提高农杆菌转化效率，外植体预培养后，细胞进入快速分裂并形成愈伤组织，处于活跃分裂期的细胞增加了对农杆菌的敏感性。

本试验在不同菌液浓度和侵染时间下进行农杆菌转化，结果发现其GUS表达率均较高，这可能由于实验中使用了对农杆菌非常敏感的基因型新春9号。从实验结果可以看出，菌液浓度OD600值为1.0时GUS基因的瞬时表达率最高，而菌液浓度提高至1.5时GUS的表达率反而有所降低，刘香利等［12］的研究中也出现这种现象，认为可能是由于高浓度的菌液对于愈伤组织细胞产生了损害，造成表达效率的降低。考虑到短时间的侵染有利于后续抑菌处理和培养，农杆菌介导的小麦遗传转化侵染时间选择15min为宜。

4 结 论

筛选得到了对农杆菌C 58C1非常敏感的3个小麦基因型：新春9号、小偃328和济麦19；利用农杆菌菌株C 58C1转化的适宜条件为：幼胚经过4～7d的预培养，在菌液浓度OD600＝1.0时进行15min的侵染，可以获得较好的转化效果。

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