自体富血小板血浆对自体脂肪颗粒移植存活作用的研究进展

谭流畅，马桂娥



自体富血小板血浆对自体脂肪颗粒移植存活作用的研究进展

谭流畅，马桂娥

富血小板血浆； 脂肪移植； 脂肪存活率;血管化； 脂肪来源干细胞； 前脂肪细胞； 增殖分化

1 背景介绍

1893年F Neuber首次提出自体脂肪移植，脂肪移植作为一种自体填充材料用于肿瘤切除术后、先天畸形、创伤等软组织缺损的修复，被广泛应用于整形外科和其他相关领域[1]。由于脂肪组织具有生物相容性和再生修复作用，因此脂肪注射也被用于瘢痕、放射治疗后、免疫相关软组织缺损[2-3]的修复。尽管自体脂肪移植有许多优点，如具有良好的生物相容性、较容易获得、移植后形态自然，但是移植后脂肪存活数量的不确定性和脂肪液化坏死等问题一直存在。吸收和脂肪坏死被认为是由于移植脂肪周围新生血管不足，从而导致脂肪细胞缺乏营养供给和代谢废物的积累。为了提高脂肪存活率，许多研究者在SR Coleman(1998年)研究的基础上，从脂肪的获取、脂肪处理、脂肪移植过程等方面进行了研究。但是，并没有相关研究证明一种技术明显优于其他技术[4]。因此，近年来研究者更多的关注于一些促进脂肪存活的策略。基于安全、高效、经济、易于实施并且不需要复杂的实验室处理以及极小并发症的原则，在脂肪移植过程中加入基质血管成分细胞(stromal vascular fraction， SVF)、促血管生长因子[5]、胰岛素、促红细胞生成素、富血小板血浆(platelet-richplasma， PRP)等[6-9]。这些方法中，自体PRP被广泛应用于外科治疗中，如软骨组织的创伤修复、创面愈合、整形外科等[10-11]。PRP对脂肪移植物存活的作用成为国内外学者的研究热点，笔者现将相关机制研究进展综述如下。

2 PRP概述

PRP是由全血离心获得的浓缩物。用来分离PRP的血液样本应该在手术开始时采集，因为手术创伤会使血小板聚集，启动凝血过程，从而减少循环血小板数量[12]。血小板参与凝血过程，但同时也有促进细胞增殖、趋化、血管再生、细胞分化、细胞外基质合成的功能，这一切都对组织再生具有潜在作用，间接表明了其在增加自体脂肪移植存活中的作用。PRP中的血小板被激活后，α颗粒可释放多种生长因子，作用于细胞膜，激活细胞内蛋白通路，启动酪氨酸激酶磷酸化并激活特定的信号转导通路进入细胞核，表达特定的基因[13]。有研究表明，这些生长因子通过相互协同作用，可促进脂肪干细胞的分裂和增殖以及移植脂肪的血管化。PRP能促进和提高脂肪移植的成活率，其主要机制在于：⑴移植脂肪的血管化。PRP中的血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等都可以促进移植脂肪新生血管的形成，使移植脂肪早期血管化，减少了移植脂肪的缺血性坏死和继发性脂肪液化与吸收的发生。⑵促进脂肪干细胞的增殖和转化。细胞的分裂增殖离不开生长因子，血小板激活时，通过α颗粒的胞吐作用释放大量生长因子，其中血小板源性生长因子、β转化生长因子可促进脂肪干细胞的增殖，增强其转化为脂肪细胞的活性及数量。大多数的分析研究表明，应用合适浓度的PRP与脂肪组织共同移植，其效果优于对照组(单纯脂肪移植)。

3 研究证据

3.1 动物实验研究证据 近年来，大量基础研究证实，激活的PRP应用于脂肪移植能促进血管新生,减轻炎症反应程度，提高脂肪细胞的成活率。Nakamura等[14]通过大鼠模型研究发现，在120 d实验观察期间，添加PRP的实验组在组织学镜下可发现新增的肉芽组织和毛细血管形成，表明PRP能有效刺激血管新生；Seyhan等[15]的大鼠模型研究也发现，PRP可提高脂肪移植的成活率；另一项研究以新西兰兔为模型，将PRP与自体脂肪以1∶1比例移植，在第8周和第12周观察到，PRP组较对照组表现为较轻的炎症反应和更少的油脂和囊肿形成，而在纤维化、血管生成、脂肪体积方面没有发现差异[16]。Choi等[17]以兔为研究对象，将脂肪组织与PRP等体积混合移植到皮下，结果显示PRP组存活脂肪细胞数和新生血管数均高于对照组，同时坏死和炎症反应面积均较对照组小。刘景兰等[18]用裸鼠模型研究PRP联合脂肪干细胞对颗粒脂肪移植血运重建的影响，发现两者联合组较其他对照组微血管数量多，且血管内皮细胞CD34阳性表达率较其余各组明显升高，脂肪细胞形态良好，呈叶状，纤维结缔组织少，可见血运重建对移植脂肪成活的重要性。

3.2 临床应用研究证据 PRP用于乳房自体脂肪移植，Salgarello等[19]将10%PRP和自体脂肪联合移植隆乳(17例)与自体脂肪单独移植隆乳(25例)的效果进行了比较，利用超声影像进行评价，结果发现，两组在脂肪液化坏死方面的差异无统计学意义，阴性结果可能与样本量较小、仅用简单的评分体系评价有关。2012年，Gentile等[20]进行了一项自体脂肪移植用于乳房再造的对比研究，1年后随访发现，PRP和脂肪组、SVF和脂肪组、对照组的移植脂肪体积保留率分别为63%、69%、39%。2013年，Fiaschetti等[21]做了进一步研究，为了更客观的评价脂肪成活率，引用超声、核磁和乳腺X线，发现术后6个月平均吸收率是15.36%，12个月是28.23%。2013年，Cervelli等[22]研究了不同浓度PRP的移植脂肪成活率，结果表明，PRP浓度与移植脂肪成活率呈正相关关系。

4 PRP提高脂肪移植成活率的可能机制

移植的自体脂肪颗粒早期通过营养物质的离子扩散，并从周围组织供应氧气，直到移植组织的血运重新建立。大量的基础实验和临床应用已经证实，移植的自体脂肪颗粒组织可以通过组织间的渗透供养直至血运重建而成活下来，血管是从周边向中心生长，增多的血管成为脂肪移植后供血的主要渠道，说明了移植区血运的重建是脂肪移植成活的关键。 Kato等[23]认为,移植后的脂肪组织按照存活情况可分为：最外层 (存活区, surviving zone)、中间区域 (再生区, regenerating zone)、最中心层(坏死区, necrotic zone)。在早期缺血、缺氧的环境下， 仅最外层的脂肪细胞能够存活， 内部的脂肪细胞因缺少供血供氧不能存活。中间区域能耐受缺血缺氧的ADSCs和前脂肪细胞部分能存活， 进而分化为成熟脂肪细胞；最中心层的细胞最不易存活，最终将被吸收或被纤维结缔组织取代。

4.1 PRP促进早期血管化 脂肪移植后，早期能否建立充足的血供对移植脂肪的成活至关重要。移植的脂肪对缺血再灌注损伤所发生的损害非常敏感，因此保留脂肪小叶的移植脂肪组织在短时间内可重新建立血液供应，进而降低移植脂肪的吸收率。脂肪组织是被认为是一个内分泌器官，能在全身水平分泌一些脂肪因子，如瘦素和内脏脂肪组织来源的丝氨酸蛋白酶抑制剂。这表明脂肪颗粒能促进早期建立脂肪移植后的血供[24]。PRP在激活后，可释放对促进血管新生有趋化作用的生长因子。有离体实验研究表明，PRP中促进血管新生的生长因子包括：间质细胞衍生因子1、胰岛素样生长因子1、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子等[25]。同时，毛细血管内皮细胞和ADSCs能自分泌/旁分泌表达整合素αvβ3和PAI-1，参与到毛细血管再生过程中[26]。相关组织工程研究表明[27]，免疫荧光染色时胞核呈绿色的脂肪细胞和部分新生血管内皮细胞是由外源性植入的脂肪干细胞分化而来；表明外源性植入的脂肪干细胞和内源性的血管内皮共同参与了新生脂肪组织的血管化过程；这种内源性的内皮细胞最有可能来自皮下组织的毛细血管网。由此可见，自体富血小板血浆能够更好地促进移植物种子细胞的血管化过程，加快移植物血运重建的速度，从而保证更多的种子细胞成活。4.2 PRP促进ASDCs增殖分化 王喻[28]研究发现，PRP对ADSCs体外增殖的促进作用可能与其对cyclinD1表达的上调作用有关，同时发现，PRP也提高了CDK抑制剂p27Kip1的蛋白水平，提示PRP可能通过提高p27Kip1的蛋白水平抑制了ADSCs的过度增殖；有研究证实，脂肪移植过程中富含新鲜分离的基质血管成分，混合的细胞群中包含小部分脂肪干细胞[29]；脂肪组织中含有的脂肪来源干细胞有分化成多种细胞谱系的潜能，包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞和其他类型的细胞[30-31]；同时，脂肪干细胞可通过分泌生长因子促进血管新生，这有利于移植脂肪的存活。PRP中的转化生长因子可以诱导间充质细胞向脂肪细胞分化，同时PRP诱导的脂肪干细胞中可检测到成脂相关基因过氧化物酶体激活受体γ及脂蛋白脂肪酶表达升高，说明富血小板血浆可促进脂肪干细胞的成脂分化[32]；Liu等[33]研究发现，PRP能正调节成骨过程，而负调节前脂细胞转换为脂肪细胞的过程(3T3-L1细胞株)。同时也发现，PRP能通过增加成骨细胞特异性基因表达(如RunxII、OPN、OCN等)，减少脂肪细胞特异性基因(如PPAR-r)的表达，从而使脂肪细胞向成骨细胞分化；Gentile等[20]通过PRP和重组人胰岛素对离体人ADSCs的培养，发现其可通过丝氨酸/苏氨酸激酶Akt蛋白依赖机制的通路，诱导脂肪干细胞向脂肪细胞分化，从而促进脂肪细胞的存活；Gentile等[34]研究了不同浓度的PRP对离体ADSCs的作用，结果发现PRP浓度在0.2～0.4 ml时，其对ADSCs的增殖作用随浓度增加而增强，更高浓度的PRP没有进一步地促进作用；另一个离体实验[35]表明，PRP有促进ADSCs增殖的作用，PRP有望取代胎牛血清成为更有前景的培养基成分。10 d培养的研究结果显示，与传统的胎牛血清相比，合适浓度的nPRP(未激活PRP)和tPRP(凝血酶激活PRP)均优于传统胎牛血清，具有统计学意义；有研究者推测，nPRP中的未激活的血小板逐渐活化并释放生长因子(而不是tPRP中生长因子短时间释放)可以模拟生理情况的血小板活化过程[36]。4.3 PRP调节炎症因子和肿胀过程 除了在炎症反应和组织愈合过程中产生一系列炎症趋化因子，血小板也表达趋化因子(如CCR1、CCR3、CCR4和CXCR4)。它们参与到炎症应答过程中，通过抗炎性细胞因子(如TGF-β)防止过多的白细胞聚集。在离体实验中，证实PRP抑制炎症通路中的酶反应(如环氧化酶1(COX-1)、环氧化酶2(COX-2)和膜结合型前列素E合成酶(mPGES)。环氧化酶(特别是环氧化酶2)是主要的炎症因子[37]。环氧化酶是髓过氧化物酶，存在于内质网和核膜上，在多种组织中都表达。此外，高浓度的前列腺素E2(PGE2)不仅加剧炎症反应，也会抑制细胞分裂。在体内实验中，注射PRP可减少PGE2，并降低d-COX-1,COX-2,和mPGES的表达。这表明PRP可能有抗炎的作用[38-39]。4.4 PRP提高分化前脂肪细胞的抗凋亡活性 Fukaya等[40]定义了来源于脂肪组织的分化前脂肪细胞。其研究发现，2%PRP+2%FBS与2%PPP相比，能更强地抑制血清缺乏以及TNF-α/放线菌酮相关的凋亡过程。研究者还发现，在2%PRP培养基中，DAPK1和BIM(Bcl-2-interacting mediator)mRNA基因表达较其余两组减少5%～10%。结果表明，前脂肪细胞的抗凋亡活性与DAPK1和BIM基因的表达相关；也有文献报道，富小板血浆激活后形成丰富的纤维网络对促进细胞黏附,防止细胞流失具有一定作用[41]，也对降低脂肪移植的吸收起到积极作用。

5 前景展望

基于上述文献，我们可知，PRP脂肪移植的主要贡献包括限制炎症和改善组织愈合与再生。同时，在脂肪细胞分化和血管生成的过程中起重要作用。这些因素可能起协同作用，促进脂肪再生。将自体富血小板血浆与脂肪干细胞植入体内，构建组织工程化脂肪，证实是可行的；虽然PRP提高移植脂肪存活率在临床应用上取得了显著的效果[42-43]，但支持PRP和脂肪移植应用于软组织修复的证据仍然有限，只有一些基础研究和动物实验[44]，仍然缺乏大样本、多中心的临床循证医学证据；而且，进一步的分子机制和蛋白质组学方面的研究， PRP参与骨髓间充质干细胞增殖和分化的信号通路等问题，是今后的研究方向；在PRP的制备和应用过程中，仍然缺乏规范的标准；PRP与脂肪的浓度比，最佳的激活物和激活方式，PRP的制备是否需要个体化，脂肪存活率的客观量化指标，采用更为客观的3d-MD、CT和 MRI评价技术取代主观的评分[45]等问题仍需要进一步研究。

[1] 黄乐彬, 马桂娥, 顾云鹏, 等. 自体脂肪颗粒移植联合局部组织瓣在血管瘤治疗后继发上唇畸形修复中的临床应用[J]. 中国美容整形外科杂志, 2014,25(12):724-726.

[2] 刘 毅, 刘 萍, 肖 斌, 等. 自体脂肪移植矫正凹陷性瘢痕的技巧[J]. 中国美容整形外科杂志, 2014,25(12):721-723.

[3] 尹 飞, 于加平, 张 亮. 应用眶隔脂肪释放固定法矫正下眶缘半月形凹陷[J]. 中国美容整形外科杂志, 2015,26(9):530-531.

[4] Gir P, Brown SA, Oni G, et al. Fat grafting: evidence-based review on autologous fat harvesting, processing, reinjection, and storage[J]. Plast Reconstr Surg, 2012,130(1):249-258.

[5] Chung CW, Marra KG, Li H, et al. VEGF microsphere technology to enhance vascularization in fat grafting[J]. Ann Plast Surg, 2012,69(2):213-219.

[6] Hamed S, Egozi D, Kruchevsky D, et al. Erythropoietin improves the survival of fat tissue after its transplantation in nude mice[J]. PLoS One, 2010,5(11):e13986.

[7] Yoshimura K, Sato K, Aoi N, et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: Supportive use of adipose-derived stem/stromal cells[J]. Aesthetic Plast Surg, 2008,32(1):48-55.

[8] Shoshani O, Livne E, Armoni M, et al. The effect of interleukin-8 on the viability of injected adipose tissue in nude mice[J]. Plast Reconstr Surg, 2005,115(3):853-859.

[9] Yuksel E, Weinfeld AB, Cleek R, et al. Increased free fat-graft survival with the long-term, local delivery of insulin, insulin-like growth factor-I, and basic fibroblast growth factor by PLGA/PEG microspheres[J]. Plast Reconstr Surg, 2000,105(5):1712-1720.

[10] 高伟成, 陈小平, 林金德, 等. 自体PRP/PRF脂肪颗粒移植面部填充的回顾性临床分析[J]. 中国美容整形外科杂志, 2015,26(3):149-152.

[11] 赵建辉, 邱 璇, 易成刚, 等. 富血小板纤维蛋白及其在脂肪移植中的研究进展[J]. 中国美容整形外科杂志, 2013,24(8):478-480.

[12] Pietrzak WS, Eppley BL. Platelet rich plasma: biology and new technology[J]. J Craniofac Surg, 2005,16(6):1043-1054.

[13] El-Sharkawy H, Kantarci A, Deady J, et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties[J]. J Periodontol, 2007,78(4):661-669.

[14] Nakamura S, Ishihara M, Takikawa M, et al. Platelet-rich plasma (PRP) promotes survival of fat-grafts in rats[J]. Ann Plast Surg, 2010,65(1):101-106.

[15] Seyhan N, Alhan D, Ural AU, et al. The effect of combined use of platelet-rich plasma and adipose-derived stem cells on fat graft survival[J]. Ann Plast Surg, 2015,74(5):615-620.

[16] Rodriguez-Flores J, Palomar-Gallego MA, Enguita-Valls AB, et al. Influence of platelet-rich plasma on the histologic characteristics of the autologous fat graft to the upper lip of rabbits[J]. Aesthetic Plast Surg, 2011,35(4):480-486.

[17] Choi HN, Han YS, Kim SR, et al. The effect of platelet-rich plasma on survival of the composite graft and the proper time of injection in a rabbit ear composite graft model[J]. Arch Plast Surg, 2014,41(6):647-653. [18] 刘景兰, 胡 刚, 陈 锦, 等. ADSCs与PRP联合脂肪颗粒移植对血运重建的影响[J]. 中国美容整形外科杂志, 2012,23(6):327-330.

[19] Salgarello M, Visconti G, Rusciani A. Breast fat grafting with platelet-rich plasma: a comparative clinical study and current state of the art[J]. Plast Reconstr Surg, 2011,127(6):2176-2185.

[20] Gentile P, Orlandi A, Scioli MG, et al. A comparative translational study: the combined use of enhanced stromal vascular fraction and platelet-rich plasma improves fat grafting maintenance in breast reconstruction[J]. Stem Cells Transl Med, 2012,1(4):341-351.

[21] Fiaschetti V, Pistolese CA, Fornari M, et al. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma[J]. Plastic Reconstr Surg, 2013,132(4):498e-509e.

[22] Cervelli V, Bocchini I, Di Pasquali C, et al. P.R.L. platelet rich lipotransfert: our experience and current state of art in the combined use of fat and PRP[J]. Biomed Res Int, 2013,2013:434191.

[23] Kato H, Araki J, Doi K, et al. Normobaric hyperoxygenation enhances initial survival, regeneration, and final retention in fat grafting[J]. Plast Reconstr Surg, 2014,134(5):951-959.

[24] Li K, Li F, Wang H, et al. Increased survival of human free fat grafts with varying densities of human adipose-derived stem cells and platelet-rich plasma[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2014 Jun 30.

[25] Bir SC, Esaki J, Marui A, et al. Angiogenic properties of sustained release platelet-rich plasma: characterization in-vitro and in the ischemic hind limb of the mouse[J]. J Vasc Surg, 2009,50(4):870-879.

[26] Hausman GJ, Richardson RL. Adipose tissue angiogenesis[J]. J Anim Sci, 2004,82(3):925-934.

[27] Stosich MS, Moioli EK, Wu JK, et al. Bioengineering strategies to generate vascularized soft tissue grafts with sustained shape[J]. Methods, 2009,47(2):116-121.

[28] 王 喻. 富血小板血浆对大鼠脂肪来源干细胞体外增殖的影响[D]. 武汉:华中科技大学, 2013.

[29] Bourin P, Bunnell BA, Casteilla L, et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT)[J]. Cytotherapy, 2013,15(6):641-618.

[30] Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies[J]. Tissue Eng, 2001,7(2):211-228.

[31] Schenke-Layland K, Strem BM, Jordan MC, et al. Adipose tissue-derived cells improve cardiac function following myocardial infarction[J]. J Surg Res, 2009,153(2):217-223.

[32] Fux C, Mitta B, Kramer BP, et al. Dual-regulated expression of C/EBP-alpha and BMP-2 enables differential differentiation of C2C12 cells into adipocytes and osteoblasts[J]. Nucleic Acids Res, 2004,32(1):e1.

[33] Liu HY, Wu AT, Tsai CY, et al. The balance between adipogenesis and osteogenesis in bone regeneration by platelet-rich plasma for age-related osteoporosis[J]. Biomaterials, 2011,32(28):6773-6780.

[34] Gentile P, De Angelis B, Pasin M, et al. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet-rich plasma: basic and clinical evaluation for cell-based therapies in patients with scars on the face[J]. J Craniofac Surg, 2014,25(1):267-272.

[35] Atashi F, Jaconi ME, Pittet-Cuenod B, et al. Autologous platelet-rich plasma: a biological supplement to enhance adipose-derived mesenchymal stem cell expansion[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2015,21(3):253-262.

[36] Marx RE. Platelet-rich plasma: evidence to support its use[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2004,62(4):489-496.

[37] Zhang J, Middletion KK, Fu FH, et al. HGF mediates the anti-inflammatory effects of PRP on injured tendons[J]. PLoS One, 2013,8(6):e67303.

[38] Randelli PS, Arrigoni P, Cabitza P, et al. Autologous platelet rich plasma for arthroscopic rotator cuff repair. A pilot study[J]. Disabil Rehabil, 2008,30(20-22):1584-1589.

[39] Middleton KK, Barro V, Muller B, et al. Evaluation of the effects of platelet-rich plasma (PRP) therapy involved in the healing of sports-related soft tissue injuries[J]. Iowa Orthop J, 2012,32:150-163.

[40] Fukaya Y, Kuroda M, Aoyaqi Y, et al. Platelet-rich plasma inhibits the apoptosis of highly adipogenic homogeneous preadipocytes in an in vitro culture system[J]. Exp Mol Med, 2012,44(5):330-339.

[41] Mehta S, Watson JT. Platelet rich concentrate: basic science and current clinical applications[J]. J Orthop Trauma, 2008,22(6):432-438.

[42] Valerio C, Scioli MG, Gentile P, et al. Platelet-rich plasma greatly potentiates insulin-induced adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells through a serine/threonine kinase Akt-dependent mechanism and promotes clinical fat graft maintenance[J]. Stem Cells Transl Med, 2012,1(3):206-220.

[43] Gentile P, Di Pasquali C, Bocchini I, et al. Breast reconstruction with autologous fat graft mixed with platelet-rich plasma[J]. Surg Innov, 2013,20(4):370-376.

[44] Jin R, Zhang L, Zhang YG, et al. Does platelet-rich plasma enhance the survival of grafted fat? An update review[J]. Int J Clin Exp Med, 2013,6(4):252-258.

[45] Visconti G, Salgarello M. Magnetic resonance imaging and ultrasound evaluation after breast autologous fat grafting combined with platelet-rich plasma[J]. Plast Reconstr Surg, 2014,133(4):593e-594e.

100144 北京，中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院 整形十五科

谭流畅(1990-)，女，重庆人，住院医师，硕士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.02.014

2015-11-28)