重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸动力学

2016-01-13谢萌,徐鑫,咸漠等

生物加工过程 2015年6期

重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸动力学

谢萌1，徐鑫2，咸漠2,贺诗华1

(1. 西安科技大学化学与化工学院，陕西西安，710054；

2. 中国科学院生物基材料重点实验室青岛生物能源与过程研究所，山东青岛，266101)

摘要：为提高甲羟戊酸产量，探究其发酵生产规律，以重组大肠杆菌YJM16为供试菌株，进行5 L发酵罐匀速补料的高密度发酵实验，最终细胞产量达到54.48 g/L，甲羟戊酸产量达到40.43 g/L，产率为20.2%。然后根据Logistic方程、Luedeking-Piret方程和类似Luedeking-Piret方程，拟合出重组大肠杆菌高密度发酵过程中菌体生长、甲羟戊酸合成、基质消耗的动力学模型及模型参数。结果表明，甲羟戊酸的合成与重组大肠杆菌的生长速率及菌体积累量均有关。菌体生长、底物消耗模型和产物形成模型拟合度R`2分别达到了0.931 9、0.957 8和0.975 1，可用于描述利用重组大肠杆菌高密度发酵生产甲羟戊酸过程。

关键词：重组大肠杆菌；甲羟戊酸；高密度发酵；动力学模型

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.013

收稿日期：2014-10-15

基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)(2013AA050703)；青岛市基础研究项目 (12-1-4-9-(3)-jch)

作者简介：谢萌(1989—)女，天津人,硕士研究生，研究方向：生物化工；贺诗华(联系人)，副教授，E-mail：heshihua@xust.edu.cn

中图分类号：TQ225.1

文献标志码：A

文章编号：1672-3678(2015)06-0070-05

Abstract：In order to increase the production of mevalonate and study its regular pattern during fermentation process,fed-batch technique for high cell density fermentation of mevalonate production by recombinant Escherichia coli YJM16 was studied.The dry cell weight reached 54.48 g/L,the production of mevalonate was 40.43 g/L and the yield was 20.2%.The kinetics model was proposed by using the Logistic equation for cell growth， the Luedeking Piret equation for mevalonate production and the Luedeking-Piret-like equation for consumption of glucose as substrate.The mevalonates synthesis was related to the growth rate of recombinant Escherichia coli and the volume of the bacteria.The high density fermentation kinetic of mevalonate production by recombinant Escherichia coli could be well expressed by the models. The goodness-of-fit scores R`2 of the models were 0.931 9,0.957 8 and 0.975 1,respectively.

Keywords：recombinant Escherichiacoli;mevalonate;high density fermentation;kinetics model

High density fermentation kinetics of mevalonate production by recombinant Escherichia coli

XIE Meng1,XU Xin2,XIAN Mo2,HE Shihua1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering,Xi′an University of Science and Technology,Xi′an 710054,China;

2. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,CAS Key Laboratory of Biobased Materials，

Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266101,China)

甲羟戊酸(3，5-二羟基-3-甲基戊酸)是生物体内生成异戊烯焦磷酸(IPP)的中间代谢产物，是合成甾醇、萜类、类异戊二烯的重要中间体，在食品及化工行业有重要用途。Yang等[2-3]通过对大肠杆菌的甲羟戊酸代谢途径进行改造，提高了甲羟戊酸产量，进而提高了其下游产物橡胶合成单体异戊二烯的产量，在发酵40 h时达到6 g/L。Xiong等利用大肠杆菌发酵生成甲羟戊酸，酯化生成β-甲基-δ-戊内酯，并聚合成嵌段共聚物用于橡胶合成。采用重组大肠杆菌高效表达常用的高密度发酵技术[5-6]合成甲羟戊酸，提高菌体的发酵密度，最终提高产物的产量及产率，不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本，能极大地提高市场竞争力。

目前，使用生物法发酵生产有机酸的工业化品种很多，例如丁二酸、乳酸等，产品产量均达到40 g/L，而达到高密度要求，则需要菌体干质量浓度达到30 g/L以上。微生物发酵过程具有非线性、时变性和不确定性的特点。特别是高密度发酵周期长，且采用补料分批发酵的方式，其动力学参数复杂，因此，目前大多基于遗传算法等复杂模型[10-12]来优化高密度发酵过程。

笔者拟在5 L发酵罐的小试中，利用匀速补料批式发酵来实现重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸。同时通过对发酵过程的数据进行分析，研究菌体生长、基质消耗及产物生成之间的动力学关系，证实常用的Logistic方程、Luedeking-Piret方程及类似Luedeking-Piret方程是否适用于高密度发酵动力学研究。该模型参数简单，可使用常用软件Origin进行拟合，以避免繁多的参数设置和专业软件的计算过程。

1材料与方法

1.1　材料与仪器

重组大肠杆菌：YJM16(E.coliBL21(DE3)/pYJM16)，由中国科学院青岛生物能源与过程研究所生物基化学品团队构建并保藏。

5 L发酵罐，德国Sartorius公司；ZHWY-1112B型恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；1-14型台式高速离心机，德国Sigma公司；Vortex-Genie-2型涡漩振荡器，美国Scientific Industries公司；SBA-40D型生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；450-GC-8400型气相色谱仪、Cary 50 UV-Vis型紫外分光光度计，美国Varian公司。

1.2　培养基

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸粉5、NaCl 10。pH 7.0。

M9基本培养基(g/L)：Na2HPO4·12H2O 15.12、KH2PO43、NaCl 0.5、NH4Cl 1、MgSO4·7H2O 0.24、葡萄糖20、氯霉素0.034。

发酵培养基(g/L)：KH2PO42.5、(NH4)2SO43、C6H8O7·H2O 1、C6H5Na3O7·2H2O 1、KCl 1.86、FeSO4·7H2O 0.08、MgSO4·7H2O 0.24、牛肉浸粉1、甜菜碱1、微量元素0.001、葡萄糖20、氯霉素0.034。

微量元素配方(质量分数)：ZnSO4·7H2O 0.29%、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.37%、H3BO32.47%、CuSO4·5H2O 0.25%、MnCl2·4H2O 1.58%。

1.3　实验方法

1.3.1种子液培养

一级种子：从菌种LB平板上挑取一个饱满的单菌落，接种到装有10 mL LB培养基的100 mL三角瓶里，37 ℃培养12 h。

二级种子：一级种子以1%的接种量接至装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃培养12 h。

1.3.2补料分批发酵过程

补料分批发酵采用5 L发酵罐，加入3 L发酵培养基，121 ℃灭菌30 min。冷却后接入100 mL种子液，37 ℃培养1 h，之后持续32 ℃，溶氧控制在20%，通过自动流加氨水将pH控制在7.0，补料设置为发酵13 h后6%自动流加。自接种后间隔几小时取样20 mL，分别测定OD、干质量浓度、残糖量、甲羟戊酸产量及副产物产量，培养至13 h，加入0.1 mol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。

1.3.3发酵过程中参数的确定

菌体生物量的测定采用干质量浓度法。取发酵液5 mL于已知质量的离心管中，用高速离心机 6 000 r/min离心10 min，弃上清液，再加去离子水悬浮离心2次，获沉淀，放入80 ℃的烘箱内烘干至恒质量。称质量，计算得知菌体干质量浓度。

甲羟戊酸的测定：取5 mL发酵液于50 mL离心管中离心，5 000 r/min离心10 min；将上清液倒入干净的50 mL离心管中，加入1 mol/L盐酸调节至pH2.0；45 ℃水浴45 min；加入2.5 g无水Na2SO4和10 mL乙酸乙酯，充分振荡，分层；用1 mL针管取上清液，使用有机相滤膜过滤到气相小瓶中，用450-GC-8400型气相色谱仪进行检测。

葡萄糖含量的测定：取发酵液1 mL，用高速离心机6 000 r/min离心5 min，取上清液，使用SBA-40D型生物传感分析仪测定。

1.3.4数据的获取及处理

从发酵开始计时，7 h开始取样，测定不同时期菌体生物量、甲羟戊酸产量及葡萄糖浓度，并用Origin 8.5绘图软件对动力学方程进行非线性拟合，绘制动力学曲线，以获得最佳动力学模型参数。

2结果与讨论

2.1　重组大肠杆菌产甲羟戊酸高密度发酵过程

高密度培养是在保证生长速率的前提下，尽可能提高细胞密度，使体积生产率大幅提高，其实现的主要方式为分批补料培养。图1为重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸发酵过程曲线，显示了细胞生物量(DCW)、残糖浓度(RG)及甲羟戊酸浓度随时间的变化趋势。由图1可知：重组菌高密度发酵过程可分为4个阶段。第一阶段为延滞期，即菌株接种至发酵罐后的短暂适应期。第二阶段为对数生长期，菌体迅速生长，最大比生长速率出现在此阶段，同时，该阶段菌体相关酶活达到最佳。为达到较高的细胞密度，以提高甲羟戊酸产量，选择在对数后期，即培养20 h后，细胞生物量为22 g/L时，加入IPTG诱导，发酵进入第三阶段——产物生成期。这一时期菌体以低于对数期的比生长速率继续生长，产物积累迅速，甲羟戊酸的最大比生成速率及最高产率均出现在这个阶段。第四阶段是衰亡期，这一时期菌体开始衰亡，导致生物量下降，同时甲羟戊酸生产速率减慢。发酵结束时，菌体产量达到54.48 g/L，甲羟戊酸产量达到40.43 g/L，产率为20.2%。

图1　重组大肠杆菌产甲羟戊酸发酵进程曲线 Fig.1　 Fermentation curves of mevalonate produced by recombinant Escherichia coli

2.2　甲羟戊酸高密度发酵的动力学模型分析

研究者通常采用基于菌体生长动力学的Logistic方程、Luedeking-Piret方程及类似Luedeking-Piret方程等动力学方程来研究分批发酵中菌体生长、基质消耗及产物生成之间的动力学关系[13]。为达到较高的细胞密度，笔者采用匀速补料分批发酵模式。通过对实验数据的分析，做出如下假定：①甲羟戊酸分批发酵过程中菌体浓度的增加对自身生长存在抑制作用；②葡萄糖的消耗仅用于菌体生长和维持菌体代谢，葡萄糖消耗速率由细胞浓度、细胞生长和甲羟戊酸合成决定；③产物生成期，甲羟戊酸大量合成，衰亡期甲羟戊酸合成速率逐渐降低。

2.2.1菌体生长动力学模型

描述细胞生长动力学普遍采用的是Logistic方程，它广泛应用于分批发酵的细胞，能较好地描述分批发酵过程中因菌体浓度的增加对菌体自身存在的抑制效应[14-15]。该方程被看作是一个表现细胞生长与营养物质之间非线性关系的经验方程[16-17]。本实验中，大肠杆菌的生长曲线为较标准的S型，故采用Logistic方程作为研究重组大肠杆菌的菌体生长动力学模型，见式(1)。

(1)

式中：X为菌体生物量(g/L)；Xm为最大菌体生物量(g/L)；μm为菌体最大比生长速率(h-1)；t为时间(h)。

将式(1)积分为代数方程，见式(2)。

(2)

式中：X0为初始菌体生物量(g/L)。

将图1数据代入式(2)进行非线性拟合，得到生长动力学参数X0、Xm和μm值分别为5.428 61、50.570 36和0.072 64，代入式(2)获得菌体生长动力学方程，见式(3)。

(3)

由Logistic方程获得的式(3)预测的模型值与实验数据进行对比验证，结果见图2。

图2　菌体生长的实验值与模型计算值的比较 Fig.2　 Comparison of experimental data with calculated data on cell growth

由图2可知，实验数据与公式(3)的计算值基本吻合，R2=0.931 9，结果表明实验值与动力学模型基本符合，但是总体拟合度低于分批发酵[18]，其中对数前期实验值与拟合值并非完美贴合，其原因在于，随着培养时间的延长，目标产物甲羟戊酸及其他代谢副产物的积累对菌体的抑制作用越来越明显，而Logistic方程获得的是更为贴合发酵后期的局部最优解。重组大肠杆菌细胞生长基本可参考依据该动力学模型。

2.2.2甲羟戊酸合成动力学模型

由于微生物在发酵的动态过程中具有十分复杂的合成途径，代谢调节机制也各具特点，所以根据产物生成速率与细胞生长速率之间的动态关系，可将其动力学模型分为三类：①生长偶联型；②部分生长偶联型或称混合型；③非生长偶联型[19-20]，常用Luedeking-Piret方程[21-22]描述产物形成与细胞生长的关系，见式(4)。

(4)

式中：P为甲羟戊酸产量(g/L)；X为菌体生物量(g/L)；α为生长偶联系数；β为非生偶联系数。

α≠0、β=0表示第Ⅰ发酵；α≠0、β≠0表示第Ⅱ类发酵；α=0、β≠0表示第Ⅲ类发酵。从大肠杆菌产甲羟戊酸分批发酵实验结果可以推断该菌体的发酵过程属于第Ⅱ类，即产物形成与细胞生长呈部分偶联型。联合公式(2)和(4)，Luedeking-Piret方程可积分为代数方程，见式(5)。

(5)

式中P0为甲羟戊酸初始产量(g/L)。由于P0=0，X0对产量的影响可以忽略不计，式(5)可简化为

(6)

将菌体生长动力学参数X0、Xm和μm值分别代入式(6)，利用图1的实验数据进行非线性拟合，得到产物生成动力学参数α和β，其值分别为0.286 35和0.011 59，代入式(6)，获得产物浓度与时间的关系,见式(7)。

(7)

由Luedeking-Piret方程获得的式(7)预测模型值与实验数据进行对比验证，结果见图3。

图3　甲羟戊酸产量的实验值与模型计算值的比较 Fig.3　 Comparison of experimental data with calculated data on MVA yield

由图3可知，实验数据与公式(7)的计算值基本吻合，R2=0.957 9。

2.2.3基质消耗动力学模型

大肠杆菌产甲羟戊酸发酵过程中，葡萄糖的消耗一方面用于菌体生长，同时又用于其菌体细胞的维持和产物的合成及代谢，因此，基质消耗可以由类似Luedeking-Piret的式(8)来表示。

(8)

式中：S为葡萄糖质量浓度(g/L)；X为菌体生物量(g/L)；YX/S为碳源用于菌体生长的得率常数(g/g)；YP/S为碳源用于产物积累得率常数(g/g)；γ为菌体维持系数(g/g)。

为避免生成乙酸、乙醇等副产物，提高甲羟戊酸产量及产率，采用匀速补料方式进行补糖，将残糖量控制在低于1 g/L。因此，补糖阶段(即产物生成阶段)未进行拟合，忽略用于产物生成的葡萄糖消耗部分，动力学方程简化为式(9)。

(9)

结合式(2)、式(9)积分可得

(10)

式中：S0为初始葡萄糖质量浓度(g/L)；λ=1/YX/S。

将菌体生长动力学参数X0、Xm和μm值分别代入式(6)，利用图1的实验数据进行非线性拟合，得到产物形成动力学参数S0、λ和γ，其值分别为20.091 6、-23.247 7和1.658 5，代入式(10)，得产物浓度与时间的关系式，如式(11)所示。

(11)

对于由式(11)获得方程与实验数据进行非线性拟合，结果见图4，R2=0.975 1。图4为补料前的基质消耗模型，其中小图是发酵全程的基质剩余曲线，表明补料后基质基本为零。由于采用分批补料方式，底物消耗的实验值较少，但基本可拟合出残糖浓度变化的趋势。该模型能够较好地描述甲羟戊酸合成前的基质消耗情况。

图4　基质消耗的动力学模型与实验数据的比较 Fig.4　 Comparison of kinetic model data with experimental data on substrate consumption

3结论

以重组大肠杆菌YJM16为供试菌株，进行5 L发酵罐匀速补料的高密度发酵实验，最终细胞生物量达到54.48 g/L，甲羟戊酸产量达到40.43 g/L，产率为20.2%。通过计算得出菌体生长动力学模型、产物生成模型和基质消耗动力学模型，R2分别达到了0.931 9、0.957 8和0.975 1。本研究建立的模型基本符合大肠杆菌细胞生长规律，能够反映甲羟戊酸高密度发酵的过程，同时该模型参数简单，避免了繁多的参数设置和专业软件的计算过程，可为高密度发酵工艺的优化放大提供理论依据。

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