胎盘生长因子基因沉默对人脐静脉内皮细胞炎症因子表达的影响

胎盘生长因子基因沉默对人脐静脉内皮细胞炎症因子表达的影响

李海芳1，苏卫东1，刘传丽2，徐晨1，邱丽君1

(1天津市第四中心医院，天津300140；2武警后勤学院附属医院)

摘要：目的观察沉默胎盘生长因子(PGF)基因对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎性因子表达的影响。方法体外培养HUVECs细胞至第3代，分为A、B、C、D、E组。A组转染siRNA-NC质粒(为非特异性沉默对照质粒)，B组转染siRNA-PGF质粒，C组转染siRNA-NC+pcDNA3质粒(为NF-κB过表达对照质粒)，D组转染siRNA-PGF+pcDNA3质粒，E组转染siRNA-PGF+pcDNA3-NF-κB质粒。上述各组转染24 h后与100 ng/mL的LPS共孵育24 h，收集各组细胞及细胞上清液，分别用于相关细胞因子mRNA(实时荧光定量PCR法)及蛋白(ELISA法)的检测。结果与A组相比，B组MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA和蛋白的表达均明显下降，两组相比，P均<0.05。与D组相比，E组MCP-1、IL-1、TNF-α mRNA和蛋白的表达均上升，两组相比，P均<0.05。结论 沉默PGF基因可以通过NF-κB信号通路的介导在mRNA和蛋白水平上抑制HUVECs炎症因子MCP-1、IL-1、TNF-α的表达，从而减轻炎症反应。

关键词：胎盘生长因子；基因沿默;脂多糖；动脉粥样硬化；人脐静脉内皮细胞;炎性因子

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.009

中图分类号：R543;Q78 文献标志码：A

基金项目：天津市第四中心医院博硕基金资助项目。

收稿日期：(2015-07-16)

通信作者：邱丽君

动脉粥样硬化(AS)是由炎症因子和趋化因子介导的全身炎症及免疫反应性疾病[1]。内皮细胞功能失调(尤其是炎症反应)被认为是AS发病机制中的一个关键性环节。炎性因子脂多糖(LPS)能诱导内皮细胞产生炎症反应[2]。研究[3，4]发现，胎盘生长因子(PGF)能够在血管新生、侧支血管生成、造血、肿瘤发生、炎症反应动和AS等方面发挥作用，但其作用机制尚不明确。2015年1月，我们观察了沉默PGF基因对LPS诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎性因子表达的影响，探讨PGF在AS发病中的作用机制。

1材料与方法

1.1LPS的配置将10 mg的LPS加入1 mL的PBS，配制成10 g/L的LPS母液，分装后置-20 ℃保存，使用前用DMEM培养液配制成终浓度为10 mg/L的LPS培养液。

1.2HUVECs的培养及鉴定取新鲜人脐带(由武警后勤学院附属医院提供，离体时间不超过2 h，产妇知情同意)，长约20 cm，无菌PBS洗净后灌注0.2%胰蛋白酶20 mL，血管钳夹闭其两端，置37 ℃孵箱中10 min。收集HUVECs，1 200 r/min离心10 min，弃上清，加入培养基，置37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h。PBS洗涤，加入含有10%胎牛血清培养基中继续培养，2～3 d换液1次，至贴壁细胞70%～80%融合时消化传代。倒置相差显微镜下观察细胞呈单层鹅卵石样排列，Ⅷ因子免疫荧光染色阳性，即确定为HUVECs。

1.3HUVECs分组、PGF基因沉默及其炎症因子mRNA和蛋白的检测① HUVECs分组：取第3代HUVECs接种到12孔板，待细胞长满时随机分组，分别为A、B、C、D、E组，每组6孔。②基因质粒转染：首先构建PGF沉默质粒(siRNA-PGF)且实验结果表明该质粒可有效干扰HUVECs的PGF表达。构建NF-κB过表达质粒(pcDNA3-NF-κB)且实验结果表明该质粒可明显升高HUVECs的NF-κB表达。A组转染siRNA-NC质粒，B组转染siRNA-PGF质粒，C组转染siRNA-NC+pcDNA3质粒，D组转染siRNA-PGF+pcDNA3质粒，E组转染siRNA-PGF+pcDNA3-NF-κB质粒。其中，siRNA-NC为非特异性沉默对照质粒，pcDNA3为NF-κB过表达对照质粒。上述各组转染不同基因质粒24 h后与100 ng/mL的LPS共孵育24 h。分别收集各组细胞及细胞上清液，用于相关细胞因子mRNA及蛋白的检测。A组和B组检测单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及核因子κB(NF-κB)的mRNA和蛋白；C、D、E组检测MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α的 mRNA和蛋白。③HUVECs炎症因子mRNA检测：采用实时荧光定量PCR法。抽提各组HUVECs总RNA，逆转录得到cDNA后进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系20 μL，其中含SYBR Premix EX Taq II(2×)10 μL 、ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL 、反转录产物4 μL 、上下游引物各0.5 μL、dH2O 3.6 μL。PCR反应条件为90 ℃ 12 min进行预变性，然后两步法进行扩增，95 ℃ 10 s、58 ℃ 40 s，共42个循环。将目的基因的Ct值用GAPDH的Ct值进行标准化，并以此作为目的基因的相对表达量。④HUVECs培养上清液中炎症因子蛋白检测：采用ELISA法。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，在实验板内每孔加标准品及待测HUVECs上清液，37 ℃反应120 min；甩去板内液体，洗板；每孔加酶标抗体工作液，37 ℃反应60 min；甩去板内液体，洗板；每孔加入底物工作液，37 ℃暗处反应15 min；最后加入终止液，用酶标仪在450 nm处测吸光度值。

2结果

2.1A、B组炎症因子mRNA和蛋白的表达比较A、B组炎症因子mRNA和蛋白的表达见表1、2。表1、2显示，与A组相比，B组转染siRNA-PGF沉默PGF的表达后，HUVECs 的MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA和蛋白表达量均减少。

表1　 A、B组炎症因子mRNA的表达比较

注：与A组相比，*P<0.05。

表2　A、B组炎症因子蛋白的表达比较(吸光度值， ± s)

注：与A组相比，*P<0.05。

2.2C、D、E组炎症因子mRNA和蛋白的表达比较C、D、E组炎症因子mRNA和蛋白的表达见表3、4。表3、4显示，过表达NF-κB可挽救沉默PGF导致的HUVECs的MCP-1、IL-1、TNF-α表达下降，而对IL-6的表达没有明显影响，表明PGF可以通过NF-κB信号通路的介导调节HUVECs 的MCP-1、IL-1、TNF-α表达。

表3　C、D、E组炎症因子mRNA的表达比较

注：与C组相比，*P<0.05；与D组相比，#P<0.05。

表4　C、D、E组炎症因子蛋白的表达比较(吸光度值， ± s)

注：与C组相比，*P<0.05；与D组相比，#P<0.05。

3讨论

AS斑块的主要组成细胞为单核细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞[5～7]。内皮功能异常及内皮细胞的激活是血管病变的早期表现，在炎症、高血糖、高血脂、高胰岛素血症等影响下，各种黏附分子及趋化因子的表达增加，募集各种细胞向动脉内膜迁移，导致AS的形成[8]。LPS属于促炎症细胞因子，可刺激内皮细胞和白细胞释放一系列炎症介质，如趋化因子、氧自由基、细胞因子等，这些炎症介质可造成血管内皮细胞损伤、内皮细胞间隙增大、血管基膜暴露、中性粒细胞和单核细胞等迁移至内皮下，加剧炎症反应[9]。

MCP-1属趋化因子家族中的β亚家族，由于其氨基端含两个半胱氨酸，以Cys-Cys方式排列，因此也称为CC趋化性细胞因子，可由多种细胞合成分泌。Hoogeveen等[10]在研究血浆MCP-1水平与外周动脉疾病或冠状动脉粥样硬化性心脏病之间关系时发现，MCP-1水平随冠状动脉粥样硬化程度增加而升高，抑制MCP-1的生成或者应用MCP-1拮抗剂不仅可限制粥样斑块的进展，而且能稳定斑块。IL-1主要由活化的巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞产生，可以促进白细胞和血小板黏附于受损的内皮细胞以及血小板活化，是一种敏感和特异的急性期炎性指标。IL-6在免疫应答和炎症反应中发挥重要作用，是一种重要的炎症因子，主要作用是诱导B淋巴细胞、T淋巴细胞分化和产生抗体，诱导多种急性期蛋白质合成和分泌等。NF-κB为具有多向转录调节作用的蛋白质,与许多基因特别是免疫炎症相关基因(如各种细胞因子、趋化因子和黏附分子等)的转录调控密切相关，而这些因子又对相应细胞的活化、增殖、浸润、趋化和分泌功能起着直接的调控作用。AS斑块处的血管内皮细胞中存在NF-κB的激活[11]。

非活化的NF-κB通常在细胞胞质中与抑制性卡巴蛋白(κB)结合，炎症因子的刺激通过多种信号转导途径使IκB磷酸化，在蛋白水解酶作用下发生降解，释放NF-κB并转运至核内，诱导炎症因子如TNF、IL-6、MCP-1等表达[12]。有研究者[13]在血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠胚胎成纤维细胞中过表达PGF后，用ELISA检测到NF-κB的表达明显增加，同时发现IL-6、TNF-α表达也增加。本研究发现，在沉默PGF基因后，HUVECs的MCP-1、IL-1、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA及蛋白表达均明显减少，表明沉默PGF基因能从基因和蛋白水平抑制LPS引起的HUVECs炎症因子的表达。进一步实验发现，过表达NF-κB可以挽救沉默PGF基因诱导的MCP-1、IL-1、TNF-α的表达下降。但是，本研究并未发现NF-κB介导PGF对IL-6的调控，可能是由于不同的细胞模型所导致的。

总之，本研究结果表明，沉默PGF基因可以通过NF-κB信号通路的介导而从mRNA和蛋白水平上抑制HUVECs炎症因子MCP-1、IL-1、TNF-α的表达，从而减轻炎症反应，这有可能成为AS潜在的治疗靶点。

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