细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331对溃疡性结肠炎小鼠抑郁行为的影响

作者单位：1.100039北京，武警总医院消化科；2.100850北京，解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331对溃疡性结肠炎小鼠抑郁行为的影响

王寰1,徐阳1,屈亚威1,张成岗2,刘海峰1

【摘要】目的研究细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)小鼠抑郁行为的影响。方法将18只小鼠随机分为模型组、治疗组和对照组，每组6只。模型组与治疗组首先采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)溶液灌肠的方法建立小鼠UC模型，模型组正常喂养2 d，而治疗组在造模后4 h腹腔注射3.2 mg/kg CZLC331蛋白；对照组采用380 ml/L乙醇溶液灌肠1次，正常喂养2 d。比较三组小鼠强迫游泳实验时间、小鼠悬尾实验时间、小鼠糖水偏爱百分比。结果在强迫游泳实验和悬尾实验中，治疗组小鼠不动时间[(64.7±10.4)s，(62.5±13.9)s]均低于模型组[(86.7±16.0)s，(111.3±41.1)s]，并且高于对照组[(21.0±5.3)s，(16.0±8.3)s]，差异均有统计学意义(P<0.01)。在糖水偏爱实验中，治疗组小鼠糖水偏爱(66.5±7.3)%高于模型组(34.5±4.6)%，低于对照组(77.2±7.7)%，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331可以有效改善UC小鼠的抑郁程度。

【关键词】溃疡性结肠炎；CZLC331；小鼠；抑郁

通讯作者:刘海峰, E-mail:haifengliu333@163.com

作者简介：畅海升，硕士，主治医师，E-mail:hassion001@163.com

【中国图书分类号】R574.6

Effect of flagellum protein derivative CZLC331 on the depressive behavior of mice with ulcerative colitis

WANG Huan1, XU Yang1, QU Yawei1, ZHANG Chenggang2, and LIU Haifeng1.1.Department of Gastroenterology, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China; 2.Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences; State Key Laboratory of Proteomics; Research Center for Military Cognition and Mental Hygiene of Chinese PLA, Beijing 100850, China

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of flagellum protein derivative CZLC331 on the depressive behavior of mice with ulcerative colitis. MethodsUC mice model was established by TNBS enema. Eighteen SPF male Balb/c mice were randomly and equally divided into the control group, UC model group, and CZLC331 treatment group, six mice in each group. Mice depression index was observed by forced swimming test, tail suspension experiment and sugar water consumption experiment. ResultsFor the forced swimming test and tail suspension test, the immobility time in treated mice [(64.7±10.4)s，(62.5±13.9)s]was significantly lower than in the model group[(86.7±16.0)s，(111.3±41.1)s], and significantly higher than in the control group[(21.0±5.3)s，(16.0±8.3)s]. In sugar water consumption experiment, the percentage of sucrose preference in treated mice (66.5±7.3)% was significantly higher than in model group(34.5±4.6)%, and significantly lower than in the control group(77.2±7.7)%. ConclusionsCZLC331 can effectively improve the level of depression in mice with ulcerative colitis.

【Key words】ulcerative colitis； cZLC331；mouse；depression

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因尚未完全明确的慢性非特异性炎性肠病，主要表现为腹痛、腹泻、黏液便和血便，并伴有多发性硬化症、视神经炎、骨质疏松等肠外表现[1-3]。近年来，国内外研究表明，UC 患者多合并精神心理异常，如焦虑和抑郁等，而且这些异常的心理因素会延长病程，诱导疾病复发[3]，细菌鞭毛蛋白是一种抗原物质，鞭毛抗原又称 H 抗原,是5型Toll-like受体(TLR5)激动剂。笔者采用常规原核表达方法制备了一种沙门菌鞭毛蛋白衍生物，命名为CZLC331。前期研究显示，鞭毛蛋白衍生物CZLC331对UC小鼠具有明显的治疗作用[4]。但鞭毛蛋白衍生物是否也能改善UC患者的抑郁等精神异常，国内外鲜见报道。本研究以三硝基苯磺酸( TNBS) /乙醇建立小鼠 UC 动物模型，旨在研究CZLC331对UC模型小鼠抑郁行为的影响。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物SPF级雄性Balb/c小鼠18只，6～8周龄，体重18～22 g，由军事医学科学院实验动物中心提供。

1.1.2主要试剂2,4,6-三硝基苯磺酸(Sigma公司)、液体石蜡(国药集团化学试剂北京有限公司) 、RT-PCR试剂盒(货号FSK100，购自东洋纺生物科技有限公司)、ELISA试剂盒(松原公司)。

1.1.3主要仪器VMR小动物麻醉机(北京益仁恒业科技有限公司)，小鼠灌胃针(北京健力园医疗器械有限公司)，超净工作台(YZ-875，苏州)，倒置相差显微镜(OLYMPUS，日本)， PCR扩增仪(GeneAmp，美国)，低温冰箱(SANYO，日本)，电泳仪(Bio-rad，美国)，涡旋混合器(江苏)，Gene genius凝胶成像系统(美国)。

1.2实验方法

1.2.1实验分组将18只小鼠随机分为模型组、治疗组和对照组，每组6只小鼠。前两组首先采用TNBS溶液灌肠的方法建立小鼠UC模型，治疗组在UC形成后4 h，腹腔注射3.2 mg/kg CZLC331，模型组正常喂养2 d。对照组是针对正常小鼠用以上方法将380 ml/L乙醇溶液灌肠1次，正常喂养2 d。

1.2.2模型制备首先将小鼠采用麻醉机麻醉，然后用直径2.0 mm长约5 cm的灌胃针由肛门轻缓插入(深约3 cm)并将灌肠试剂(含有150 g/L TNBS+380 ml/L乙醇溶液, 150 mg/kg)缓慢推入结肠以制备炎性肠病模型。

1.2.3CZLC331的制备首先构建沙门菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331的原核表达载体pET28b-Tat-CZLC331，然后对原核表达载体pET28b-Tat-CZLC331进行转化及菌体复苏，再对原核表达载体pET28b-Tat-CZLC331进行诱导表达，制备沙门菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白样品，最后对沙门菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白样品进行分离、纯化得到沙门菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白，纯度达95%以上。

1.2.4抑郁指数分析

1.2.4.1强迫游泳实验灌肠前1 d，小鼠适应性游泳训练，将小鼠放入高20 cm，直径15 cm的圆柱形游泳缸中，水温25 ℃，水深10 cm，15 min后将小鼠取出。灌肠后每天进行一次强迫游泳实验，共21 d。实验时，小鼠在缸内游泳6 min，记录后4 min内小鼠的累计不动时间。不动时间是指小鼠在水中停止挣扎呈漂浮状态，或仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的时间。

1.2.4.2悬尾实验小鼠灌肠后每天进行一次悬尾实验，共21 d。实验时，将小鼠尾部用胶带缠绕，松紧以不影响小鼠尾部血液循环为标准，将小鼠倒挂，用夹子夹住胶带边缘，保证小鼠尾部不会因夹子固定而产生疼痛的感觉，将夹子固定于悬尾箱顶端，记录小鼠在6 min中不动时间。

1.2.4.3糖水偏爱实验实验前训练小鼠适应饮糖水，每笼同时放置2个水瓶，第一个24 h，2瓶均装有1%蔗糖水，随后的24 h，一瓶装1%蔗糖水，另一瓶装纯水。在实验的第2天进行糖水偏爱实验，同时给予每只小鼠事先定量好的2瓶水(1瓶1%蔗糖水和1瓶纯水)，处死小鼠前，取2瓶水称量。记录动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗，计算糖水偏爱 (糖水消耗/总液体消耗×100%)。若模型组小鼠的糖水偏爱明显低于对照组或治疗组小鼠，说明其出现抑郁样行为。

2　结　　果

在强迫游泳实验和悬尾实验中，治疗组小鼠不动时间均明显低于模型组，并且高于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.01)。在糖水偏爱实验中，治疗组小鼠糖水偏爱明显高于模型组，并且低于对照组(P均<0.01，表1)。

表1　细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331

注：治疗组在UC形成后4 h，腹腔注射3.2 mg/kg CZLC331，模型组正常喂养2 d；对照组是针对正常小鼠将380 ml/L乙醇溶液灌肠1次，正常喂养2 d。与对照组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01

3　讨　　论

UC是严重影响人类健康的疾病。由于UC的发病机制至今尚不明确，因而在临床上无法针对病因进行有效的治疗。从1888年至今，5-氨基水杨酸始终是UC的一线治疗药物，但其治疗效果并不理想，即使在发病率较高的欧美发达国家，也并无治疗UC的特效药[5]。随着病情的恶化，往往不得不进行全结肠切除术，给患者带来了极大的痛苦。

近年来，国内外研究表明，UC 患者多合并精神心理异常，如焦虑和抑郁等，而且这些异常的心理因素会延长病程，诱导疾病复发。Häuser等[6]研究发现，精神心理异常在缓解期、轻度和中重度UC的发生率分别为 11.3%、27.7% 和 49.3% ，Cheng等[7]研究也表明，重度UC较轻中度UC的焦虑和抑郁更加明显。因此，许多临床医师对UC进行抗焦虑/抑郁治疗，但目前国内外系统的临床研究很少，且其疗效一直存在争议。

细菌鞭毛蛋白是一种抗原物质，是5型Toll-like受体(TLR5)激动剂，对TLR5-NF-κB信号通路具有激活作用，与TLR家族信号通路具有密切关系。Toll 样受体( Toll like receptors，TLR) 家族是一类参与病原微生物引起的先天免疫的蛋白受体家族。近年来 TLR 在机体免疫应答中的作用受到高度关注。TLR不仅在激活天然免疫中发挥重要作用，而且还在诱导和调节获得性免疫中具有重要意义，是连接天然免疫和获得性免疫的重要桥梁[8，9]。目前已发现 13 种TLR，细菌鞭毛蛋白是目前已知的惟一的 TLR5特异性配体。既往研究表明在放射损伤小鼠模型中，鞭毛蛋白衍生物对造血系统及胃肠道系统均表现出较显著的保护作用[10-11]。

笔者采用常规原核表达方法制备了一种沙门菌鞭毛蛋白衍生物，命名为CZLC331，包括Tat蛋白转导肽、沙门氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基的融合蛋白，自N端第1-176位氨基酸残基和第402-505位氨基酸残基可通过柔性连接肽连接，纯度大于95%。笔者前期研究显示，CZLC331对UC小鼠具有明显的治疗效果。但鞭毛蛋白衍生物是否也能改善UC小鼠的抑郁行为，国内外文献未见报道。本研究结果显示，通过腹腔注射CZLC331对小鼠UC模型进行治疗，明显影响UC小鼠的抑郁行为，小鼠抑郁指数明显降低。与模型组比较，治疗组游泳及悬尾实验中不动时间明显缩短，而糖水偏爱程度明显增加。

综上所述，细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331可以明显影响UC小鼠的抑郁行为，并且有效改善UC小鼠的抑郁程度，但机制不明确，是否与调节白介素家族和肿瘤坏死因子的水平有关，是否与TLR-NF-κB通路存在一定联系，是否与治疗UC的机制是同一机制，有待进一步研究。

【参考文献】

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[4]王寰, 徐阳, 屈亚威, 等. 细菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331治疗小鼠溃疡性结肠炎的疗效[J]. 世界华人消化杂志，2014, 22(30): 4573-4577.

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[9]Lyudmila G, Burdelya , Tallant T C,etal. An agonist of Toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models [J] . Science, 2008,320(5873):226-230.

[10]Vijay-Kumar M , Aitken J D, Sanders C J,etal．Flagellin treatment protects against chemicals, bacteria, viruses, and radiation[J]．lmmunol, 2008,180(12):8280- 8285.

[11]Jackson L N, Zhou Y N, Qiu S M,etal. Alternative medicine products as a novel treatment strategy for inflammatory bowel disease[J]. Am J Chin Med, 2008,36(5):953-965.

(2015-02-08收稿2015-03-06修回)

(责任编辑武建虎)