大鼠慢性应激抑郁模型的建立及其胃肠黏膜的变化

作者单位：1.100850北京，军事医学科学院放射与辐射医学研究所；2.100039北京，武警总医院消化内科

大鼠慢性应激抑郁模型的建立及其胃肠黏膜的变化

朱晓慧1,2，张成岗1，刘海峰1,2

【摘要】目的建立大鼠慢性应激抑郁模型并观察其胃肠黏膜组织的病理学变化规律。方法采用慢性不可预见性应激的方法，将12只大鼠随机分为对照组和模型组，每组6只。对照组正常饲养，模型组采用10种应激方法，包括禁食24 h、禁水24 h、夹尾(距大鼠尾根部1 cm处)5 min、昼夜颠倒24 h、4 ℃冷水游泳5 min、45 ℃环境5 min、潮湿垫料24 h、倾斜45° 24 h、行为束缚4 h、水平震荡60次/min ，45 min，28 d内随机交替处理，每天一种方法，且相同的刺激至少间隔7 d以上。造模前后记录大鼠的体重，并于造模后依次进行旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏爱实验等行为学评估，最后脱臼处死，并收集胃、回肠、盲肠、结肠等组织，包被切片后进行HE染色。结果与对照组相比，模型组大鼠体重显著降低(P=0.0064)、穿越次数显著减少(P=0.0001)、直立次数显著减少(P=0.0007)、理毛次数显著减少(P=0.0011)、强迫游泳不动时间显著延长(P=0.000006)、糖水偏爱显著降低(P=0.008152)；病理结果显示，造模后大鼠胃黏膜及肠道微绒毛结构破损严重，细胞核轻微固缩且深染。结论慢性不可预见性多种应激组合的方法可成功建立大鼠抑郁模型，组织学显示这种抑郁状态可明显损害胃肠黏膜。

【关键词】慢性应激抑郁模型；行为学评估；组织；病理学；HE染色

通讯作者：刘海峰，E-mail:haifengliu333@163.com

【中国图书分类号】R573

Construction of rat chronic stress depression model and its gastrointestinal mucosa change

ZHU Xiaohui1,2, ZHANG Chenggang1, and LIU Haifeng1,2.1.Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences; State Key Laboratory of Proteomics; Research Center for Military Cognition and Mental Hygiene of Chinese PLA, Beijing 100850, China；2.Department of Gastroenterology, General Hospital of Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Abstract【】ObjectiveTo establish the rat chronic stress depression model and observe its gastrointestinal mucosa change rularity. To study the feasibility of establishing the chronic stress depression model based on chronic unpredictable stress method followed by behavioral evaluation, and further observe the histopathological changes in stomach, ileum, cecum and colon using HE staining. MethodsThe based method of chronic unpredictable stress was used. A total of 12 healthy male rats were randomly divided into two groups: control group and model group, six in each group. Rats in control group were regularly raised, and those in model group were randomly and alternately treated in 28 days with 10 stress methods, such as fasting for 24 h, water deprivation for 24 h, tail nipping (1 cm of rat tail head) for 5min, day and night inversion for 24 h, 4 ℃-cold water swimming for 5min, 45℃ environment for 5min, damp bedding for 24 h, sloping 45° for 24 h, behavior constraint for 4 h, horizontal vibrating (60 times/min) for 45 min. One method was chosen in each day and the interval of the same stimulation exceeded 7 days at least. Then, the rat body weight was recorded and the rats were on open field test, forced swimming test, and sugar water preference test. Finally, rats were dislocated and samples of stomach, ileum, cecum and colon were collected, and sliced and Haematoxylin and eosin staining was performed. ResultsCompared with the control group, the rat body weight significantly decreased (P=0.0064), the number of passing through significantly decreased (P=0.0001), the number of upright standing significantly decreased (P=0.0007), the number of grooming significantly decreased (P=0.0011), the no moving time in forced swimming significantly prolonged (P=0.000006) and sugar water preference significantly decreased(P=0.008152). Furthermore, the gastric mucosa and the microvilli in intestinal tract were seriously damaged, and nuclei slightly contracted and deeply stained. ConclusionsMultiple chronic unpredictable stress method combination can correctly establish the rat chronic stress depression model, and the histology results demonstrate that the stress causes a signifcant damage in gastrointestinal mucosa.

【Key words】chronic stress depression model; behavioral evaluation; tissues; pathology; HE staining

生理性应激反应对机体抵御外界的刺激具有重要的预适应和保护作用，但强度过大、持续时间较长的应激反应将严重影响人体的健康，甚至可造成机体应激性抑郁及损伤[1,2]。抑郁症是一种十分常见的多因素交互诱发的心境障碍性疾病[3]，如遗传因素、生化因素、心理因素和社会因素等[4]，多数病例具有反复发作特性，不仅严重困扰患者的生活和工作，而且给其家庭和社会都造成了严重的影响和沉重的负担[5,6]。研究表明，许多胃肠疾病与抑郁有关，但其机制缺乏系统的研究。本研究拟利用目前文献报道的慢性不可预见性多种应激组合的方法，建立大鼠慢性应激抑郁模型，并观察慢性抑郁状态下大鼠胃肠黏膜及微绒毛等损伤情况，不为抑郁症作用机制的研究提供了基础动物模型，为临床防治方法的研究提供了重要依据。

1　材料与方法

1.1材料选取成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(体重200～220 g，购自解放军军事医学科学院实验动物中心)12只，随机分为对照组和模型组，每组6只。实验前适应饲养1周：自然光照，室温(22±2)℃，自由摄取食物和水，每日定时更换饲料，通风良好，排除其他应激因素干扰。

1.2大鼠慢性应激模型的建立参照文献[3]报道的慢性不可预见性应激处理方法，针对慢性应激对照组及模型组实验动物采取以下10种应激方式：禁食24 h、禁水24 h、夹尾5 min、昼夜颠倒24 h、4 ℃冷水游泳5 min、45 ℃环境5 min、潮湿垫料24 h、倾斜45°24 h、行为束缚4 h、水平震荡60次/min ,45 min，上述10种应激方法在28 d内进行随机处理，每天采取一种方法，相同的刺激不能连续出现且至少间隔7 d以上。实验前后分别测定大鼠的体重，实验结束后进行行为学评估，包括旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏爱实验。

1.3行为学评估

1.3.1旷场实验在安静、暗光环境下进行，行为测定于造模前各进行1次。将大鼠放置旷场箱中(自制旷场箱：由不透明木板制成，箱高为40 cm，底面为80 cm×80 cm的正方形，被等分成面积相等的25个等边方格，无盖，四周及底部封闭)，每次测定5 min，包括穿越格数(以穿越底面积块数为水平运动得分)、直立次数(为垂直运动得分)及理毛次数，记录各组数据后进行统计学分析。

1.3.2强迫游泳实验实验前分别将大鼠置于强迫游泳缸[自制，直径30 cm、缸高30 cm、水温(23±2)℃、水深25 cm，采用透明聚乙烯材料将缸加高至70 cm]内进行预适应游泳15 min，然后用毛巾擦干，24 h后进行强迫游泳6 min，计算大鼠后4 min在水面漂浮的累计不动时间，记录各组数据后进行统计学分析。

1.3.3糖水偏爱实验实验前给予1%蔗糖水2瓶(200 ml/瓶)进行糖水预适应训练24 h。然后，第28天给予1%蔗糖水和纯净水各1瓶(200 ml/瓶)，1 h后称量剩余体积，计算总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗和糖水偏爱(糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%)。实验完成后将大鼠进行脱臼处死，分别收集胃、回肠、盲肠、结肠等组织并置于4%多聚甲醛溶液固定备用。

1.4HE染色将上述固定24 h后的组织样本脱水、透明、浸蜡、包埋和切片。切片经过脱蜡后进行HE染色，具体步骤如下：苏木精染色5 min，自来水冲洗多余染液；1%盐酸乙醇(70%乙醇配制)分化15 s左右，镜检待细胞核和核内染色质清晰为止，自来水冲洗30 min，蒸馏水冲洗2 min；0.5%伊红溶液染色5 min，使细胞核着色；梯度乙醇各脱水3 min，70%→85%→95%→100%；二甲苯Ⅰ和Ⅱ透明10 min后中性树胶封片，采集图片并进行分析。

2　结　　果

2.1慢性应激后大鼠体重显著降低造模前模型组(224.83±3.76)大鼠的体重与对照组(228.83±6.05)相比不存在差异(P=0.1169，表1)，造模后模型组(412.50±44.20)大鼠的体重低于对照组(342.50±23.52)，差异有统计学意义(P=0.0064)。

2.2慢性应激后大鼠旷场穿越次数、直立次数、理毛次数均显著降低模型组(57.17±13.73)大鼠旷场穿越次数与对照组(110.33±9.46)相比显著降低，差异有统计学意义(P=0.0001)；模型组(7.83±2.64)大鼠旷场直立次数与对照组(21.17±5.04)相比显著降低(P=0.0007)；模型组(0.67±0.52)大鼠旷场理毛次数与对照组(3.67±1.03)相比显著降低，差异有统计学意义(P=0.0011，表1)。

2.3慢性应激后大鼠强迫游泳不动时间显著延长与对照组(8.67±2.50)相比，模型组(74.17±8.04)大鼠的强迫游泳不动时间显著延长，差异有统计学意义(P<0.000，表2)。

2.4慢性应激后大鼠糖水偏爱性显著降低与对照组(92.60±6.00)相比，模型组(80.80±6.00)大鼠的糖水偏爱性明显降低，差异有统计学意义(P=0.0082，表3)。

表1　造模后大鼠旷场实验结果及统计学分析

表2　造模后大鼠强迫游泳不动时间结果及统计学分析

表3　造模后大鼠糖水偏爱结果及统计学分析

2.5HE染色的结果慢性应激后大鼠胃肠黏膜组织及微绒毛结构破坏严重，局部区域核轻微皱缩并深染(图1)。与对照组相比，胃黏膜组织结构松散，破坏严重，细胞核皱缩且深染(图2)，回肠、盲肠、结肠组织形态结果破坏明显，微绒毛等断裂，细胞局部溶解，细胞核皱缩变形并深染。

图1　慢性应激对照组大鼠组织病理(HE,×100)

图2　慢性应激模型组大鼠组织病理(HE,×100)

3　讨　　论

应激是机体应对各种内外界环境、社会、心理因素刺激所产生的一种全身性非特异性适应反应[7]。随着社会的快速转型发展，生活节奏的加快及生活环境压力的加剧，人们面临着各种各样的应激压力，如果不能恰当的舒缓这类压力，就可能造成健康损害，甚至导致抑郁状态，这就可解释目前抑郁相关疾病明显增多的主要原因。为了模拟机体慢性应激反应，Katz等于20世纪80年代采用一系列严重应激因子处理大鼠建立了慢性不可预见性应激动物模型[8]，该模型可有效模拟人体抑郁症的应激源刺激，为深入揭示慢性应激性抑郁作用机制的研究奠定了重要基础[9]。然而，慢性应激性抑郁是复杂的过程，其具体发病机制尚未完全阐明。国内的研究现状多针对胃肠道功能的变化及其机制，对器质性损害的相关研究较少。本研究采用多种慢性不可预见性应激组合方法建模，通过旷场实验、强迫游泳实验和强迫游泳实验等行为学评估，明确抑郁状态存在，成功建立抑郁模型后观察胃肠黏膜损害的情况。

通过比较分析大鼠的体重明显降低，说明应激反应机体代谢紊乱，以致体重下降明显。深入确定大鼠抑郁指标，采用行为学评估及糖水偏爱实验其快感缺失程度，研究结果提示经过慢性应激处理后，大鼠的旷场反应性明显低于对照组，糖水偏爱性明显降低，说明大鼠处于严重的抑郁状态。

慢性应激反应中，消化器官作为直接的负累脏器表现出了明显的生理及病理性变化。为了深入阐明慢性应激后大鼠胃肠组织病理学变化，笔者利用HE染色方法对胃肠组织进行染色，采集图片分析大鼠胃、回肠、盲肠、结肠组织病理变化。结果显示，不仅胃黏膜破坏，而且大鼠回肠、盲肠、结肠组织黏膜及微绒毛等严重破坏，细胞变形。通过病理学分析结果发现，慢性应激性刺激可导致大鼠行为变慢，且脏器生理结构也受损，后续采用药物干预，以期找到合适的预防和治疗药物。

本研究利用慢性轻度不可预见性应激方法建立了大鼠慢性应激抑郁模型，通过病理学检测确定了大鼠慢性应激性损伤的变化规律，为深入揭示慢性应激抑郁的作用机制奠定了重要基础。

【参考文献】

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(2015-01-15收稿2015-03-16修回)

(责任编辑岳建华)