阿魏酸钠通过MEK/ERK/P90RSK信号通路减轻MCAO大鼠缺血后脑损伤效果分析

阿魏酸钠通过MEK/ERK/P90RSK信号通路减轻MCAO大鼠缺血后脑损伤效果分析

刘俊杰李建民赵雅宁徐继伟

(华北理工大学河北唐山063000)

[摘要]①目的观察阿魏酸钠(SF)对脑缺血的防治作用，分析其可能的保护机制。②方法采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉的方法制造大脑中动脉闭塞(MCAO)动物模型，随机分为假手术组、MCAO组、SF+假手术、SF+MCAO组，于造模前1h经尾静脉给予SF 100mg/kg和等剂量的生理盐水，24h后断头取脑，原位缺口末端标记法(TUNLE)检测凋亡神经细胞。Western bolt检测Raf-MEK-ERK通路及其下游的P90RSK、Bad蛋白磷酸化水平。③结果与模型组相比，SF干预组梗死灶的面积明显减小(P<0.05)，且凋亡细胞数量减少，MCAO组磷酸化的Raf-1、MEK1/2、ERK1/2、P90RSK、Bad较假手术组明显减少(P<0.05)，SF干预组磷酸化的Raf-1、MEK1/2、ERK1/2P90RSK、Bad较MCAO组均显著增加(P<0.05)。④结论SF可能通过MEK-ERK-P90RSK-Bad信号通路抑制MCAO后的神经元凋亡。

[关键词]脑缺血阿魏酸钠MAPKERK

[中图分类号]R 74[文献标识码]A

【基金项目】河北省科技支撑课题(编号：20276112D)；河北省教育厅自然

【作者简介】刘俊杰(1990-)，男，在读硕士研究生，医师。研究方向：脑损伤与脑保护研究。

【通讯作者】李建民。

Ferulic acid attenuates down-regulation of MEK/ERK/P90RSK signaling pathway in focal cerebral ischemic injuryLIUJunjie,LIJianmin,ZHAOYaning,etal(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ABSTRACT[]ObjectiveFerulic acid provides neuroprotective effects against a middle cerebral artery occlusion (MCAO)-induced cerebral ischemia.Mitogen-activated protein kinases can regulate extensive intracellular processes including cell differentiation,growth,and death.This study further investigated whether ferulic acid modulates a protective mechanism through the activation of Raf-MEK-ERK and its downstream targets,including 90 ribosomal S6 kinase (p90RSK) and Bad during cerebral ischemic injury.MethodsMale Sprague-Dawley rats were treated with ferulic acid (100 mg/kg) or vehicle befor the onset of MCAO and brain tissues were collected 24 h after MCAO.ResultsThese results indicated that ferulic acid decreases the volume of the infarct area and the number of cells positive in terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining. Although MCAO injury induces a decrease in the phosphorylation of Raf-1,MEK1/2,and ERK1/2,ferulic acid treatment prevents the injury-induced decrease in these phosphorylation levels.Ferulic acid also attenuates the injury-induced decrease in p90RSK and Bad phosphorylation levels.ConclusionThese findings suggest that ferulic acid prevents MCAO-induced neuronal cell death and that the MEK-ERK-p90RSK-Bad signaling pathway is involved in these neuroprotective effects.

[KEYWORDS]Brain ischemia.Ferulic acid.MAPK.ERK

脑缺血加之氧化应激和能量代谢紊乱会导致严重的脑功能受损[1]。多酚类，如阿魏酸钠(sodium ferulate,SF)，又名当归素，主要存在于植物中，在细胞的生长、繁殖过程中起着重要的作用[2]。研究已经证实，SF还可以对阿尔兹海默病、脑卒中等神经系统疾病起到保护作用，其可通过抗氧化作用及抑制神经细胞凋亡从而减轻脑缺血后的损伤[3]。笔者前期研究报道SF可通过激活Akt信号通路发挥神经保护作用。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)属于丝/苏蛋白激酶家族，P44/P42 MAPK(ERK1/2)信号通路是沟通细胞内外信号的重要通路，比如生长因子、细胞分裂素信号的传递[4]。已有研究报道SF和ERK信号通路存在一定关系，SF可通过激活Akt和ERK信号通路来阻止由于辐射导致的氧化应激造成的细胞凋亡。此外，ERK信号通路通过调节抗氧化酶的表达来调节SF的抗氧化作用[5,6]。虽然研究已经明确SF有神经保护作用，但其在大脑中动脉闭塞(MCAO)的具体保护机制尚不明确。本研究旨在探明SF是否可以通过激活Raf-MEK-ERK及其下游的靶蛋白P90RSK和Bad来发挥神经保护作用。

1材料与方法

1.1材料雄性SD大鼠，220～230g，40只，购置于北京维通利华实验动物中心(SCXK(京)2009-003)，饲养于华北理工大学实验动物中心，温度控制在25℃,明暗交替循环，自由进食水。40只大鼠随机分为4组：假手术组(Sham组)、SF+Sham组、MCAO组、SF+MCAO组。手术前1h尾静脉给SF，给药剂量为100mg/kg，对照组给予等剂量的生理盐水。

1.2药品及试剂注射用SF(0.1g)(扬子江药业集团，批号：201451678)；p-Raf、p-MEK、p-ERK、p-p90RSK、p-Bad，一抗，美国SCt公司；二抗，TUNEL染色试剂盒，碧云天生物技术有限公司。TTC染色剂，sigma公司。

1.3动物模型制造参考Longa[7]的方法，制造MCAO模型，10mg/kg水合氯醛常规麻醉，颈部正中做切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉。4/0号缝合线从颈内动脉插入，栓塞大脑中动脉。24h后4%多聚甲醛灌注取脑。Sham进行同样的操作，不进行大脑中动脉栓塞。

1.4形态学检测脑组织视交叉水平冠状位切成2mm厚，2%的2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)， 37℃孵育20min，染色，测量其梗死面积。原位细胞凋亡检测(TUNEL法) 标本多聚甲醛固定,常规石蜡切片,按TUNEL检测试剂盒进行操作,DAB显色,苏木精复染。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片,每张切片在梗死区随机选取4个视野,在200倍光镜下应用目镜网格测试系统,计数阳性细胞,取均值。

1.5免疫印迹法测定磷酸化Raf、MEK、ERK、P90RSK和Bad大鼠处死后，迅速断头取脑，取大脑右侧梗死区域皮层组织0.6g，4℃磷酸盐溶液(PBS)充分洗涤，加入3倍体积的4℃全细胞裂解液，冰浴中匀浆，4℃离心5min，3000r/min，取上清。考马斯亮蓝法测各样本的蛋白含量(南京建成生物有限公司)，样本贮存于-80℃备用。蛋白样品50μg与等体积上样缓冲液混合，煮沸10min，10% SDS-PAGE电泳、转膜、封闭液室温下震荡2～3h，加入一抗(p-Raf、p-MEK、p-ERK1/2、p-p90RSK、P-Bad,浓度均为1:1000;β-actin,1:1000)，4℃孵育过夜，PBS洗膜，标记的二抗(1:5000)，37℃孵育1h，PBS洗膜，ECL显色，图象分析仪(Amersham Pharmacia Biotech)测定光密度。

2结果

2.1大体形态结果MCAO组出现明显的梗死灶，梗死体积(33.51±3.76)，SF+MCAO组梗死灶体积明显缩小，(15.98±3.21)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A：Sham组；B:SF+Sham组；C： MCAO组；D:SF+MCAO组 图1 各组大鼠脑组织梗死面积

注：A：Sham组；B:SF+Sham组；C： MCAO组；D:SF+MCAO组 图2　各组大鼠损伤区凋亡神经细胞(TUNEL，×400)

2.2各组大鼠梗死区神经细胞凋亡情况TUNEL阳性细胞(凋亡细胞)表现为核固缩，棕黄色，可见凋亡小体，核碎片。与Sham组相比，MCAO组TUNEL阳性细胞显著增多(P<0.05)；与MCAO组相比，SF+MCAO组中TUNEL阳性细胞明显减少(P<0.05)，见图2，图3。

表1　各组大鼠缺血病灶区相关蛋白的表达量比较

注：与Sham组相比，*P<0.05；与MCAO组相比，**P<0.05

图3　各组大鼠损伤区凋亡神经细胞比较(*P<0.05)

2.3Western blot结果MCAO模型组P-Raf和P-MEK蛋白含量较Sham组明显降低(P<0.05),SF干预组P-Raf和P-MEK蛋白的表达明显上调(P<0.05)；模型组P-ERK1/2水平较Sham组下降(P<0.05)，SF干预组较模型组上调(P<0.05)，模型组P-p90RSK和P-Bad蛋白水平较Sham组明显下降(P<0.05)，SF干预组较模型组上调(P<0.05)，见表1，图4。

图4　各种大鼠损伤区相关蛋白Western blot结果

3讨论

已有研究报道，SF可发挥神经保护作用[8,9]。本研究结果显示，SF可明显减小梗死面积，减少MCAO后的神经细胞凋亡，与其他研究结果一致[10,11]。本实验结果还发现， SF干预后Raf和MEK、ERK磷酸化水平较MCAO模型组有显著上升。提示SF对Raf/MEK/ERK信号通路有调节作用，可以使该信号通路激活。MAPK是调节细胞增殖和细胞周期的关键酶，生长因子和细胞分裂素可激活Raf ，Raf是MAP上游重要的蛋白，通过Raf的磷酸化激活MEK1/2，磷酸化的MEK1/2激活下游的ERK1/2[12,13]。许清秀[14]研究发现，ERK信号通路激活可以减少锥体细胞的损伤，从而起到脑保护作用。笔者推测Raf/MEK/ERK信号通路是SF参与脑保护作用的一条重要的通路。SF可能通过MEK/ERK/P90RSK信号级联放大作用于某些下游分子来发挥MCAO损伤后神经保护功能。

为了进一步探讨SF对MCAO的脑保护机制，笔者又检测了MAPK下游相关蛋白P90RSK和Bad，P90RSK可以被磷酸化的ERK激活，Bad又可被激活的P90RSK激活，而p-Bad可以抑制细胞的凋亡[15]。本研究结果显示， SF干预后可明显提高P90RSK和Bad磷酸化水平，提示SF可能通过ERK1/2信号通路活化P90RSK、Bad。Wong等[16]研究发现活化的ERK1/2调节下游的P90RSk、转录因子Elk-1等，磷酸化的P90RSk进一步导致下游的Bad磷酸化，最终导致神经细胞凋亡被抑制。Bad是Bcl-2家族成员，p-Bad是抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的异二聚体，主要参与对抗细胞的凋亡[17]。前期研究发现，SF可以上调MCAO损伤后p-Akt及其下游靶蛋白p-Bad,p-GSK-3β的水平，通过调节Akt通路，来对抗氧化应激。综合实验结果， SF可能通过激活ERK1/2信号通路,从而提高P90RSK和Bad信号蛋白磷酸化水平，减少脑缺血后的神经细胞凋亡，发挥MCAO后的脑保护作用。

参考文献

[1]Allen C L, Bayraktutan U. Oxidative stress and its role in the pathogenesis of ischaemic stroke[J]. Int J Stroke, 2009, 4(6): 461-70

[2]刘春杰.阿魏酸钠抗炎分子机制及对奶牛子宫内膜炎疗效初步观察[D]. 长春：吉林大学, 2013

[3]周红伟, 章军建, 熊丽. 慢性脑缺血大鼠海马PARP、MDA的表达及阿魏酸钠的抗氧化作用[J]. 中风与神经疾病杂志, 2005, (03): 213-215

[4]Ulu N, Henning R H, Guner S, et al. Intracellular transactivation of epidermal growth factor receptor by alpha1A-adrenoceptor is mediated by phosphatidylinositol 3-kinase independently of activation of extracellular signal regulated kinases 1/2 and serine-threonine kinases in Chinese hamster ovary cells[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2013, 347(1): 47-56

[5]Ma Z C, Hong Q, Wang Y G, et al. Ferulic acid induces heme oxygenase-1 via activation of ERK and Nrf2[J]. Drug Discov Ther, 2011, 5(6): 299-305

[6]Jin Y, Yan E Z, Fan Y, et al. Neuroprotection by sodium ferulate against glutamate-induced apoptosis is mediated by ERK and PI3 kinase pathways[J]. Acta Pharmacol Sin, 2007, 28(12): 1881-90

[7]E.Z. Longa, P.R. Weinstein, S. Carlson,et al.Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in rat[J]. Stroke,1989, 20: 84-91

[8]Cheng C Y, Su S Y, Tang N Y, et al. Ferulic acid inhibits nitric oxide-induced apoptosis by enhancing GABA(B1) receptor expression in transient focal cerebral ischemia in rats[J]. Acta Pharmacol Sin, 2010, 31(8): 889-99

[9]Cheng C Y, Su S Y, Tang N Y, et al. Ferulic acid provides neuroprotection against oxidative stress-related apoptosis after cerebral ischemia/reperfusion injury by inhibiting ICAM-1 mRNA expression in rats[J]. Brain Res, 2008, 1209: 136-50

[10]周礼俊, 杨拯, 邱有波, 等. 阿魏酸钠治疗脑梗死的汇总分析[J]. 中国老年学杂志, 2012, (19): 4130-4133

[11]朱海勇, 徐海燕, 刘素芝, 等. 阿魏酸钠联合阿斯匹林治疗急性脑梗死临床观察[J]. 实用中西医结合临床, 2006, (05): 7-8P

[12]Hwang J H, Byun M R, Kim A R, et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation[J]. PLoS One, 2015, 10(8): e0135519

[13]Ghasemi R, Moosavi M, Zarifkar A, et al. The Interplay of Akt and ERK in Abeta Toxicity and Insulin-Mediated Protection in Primary Hippocampal Cell Culture[J]. J Mol Neurosci, 2015[Epub]

[14]许清秀.ERK通路与丙泊酚后处理大鼠的脑保护作用[D].福州：福建医科大学,2014

[15]Lee Y S, Jun H S. Anti-diabetic actions of glucagon-like peptide-1 on pancreatic beta-cells[J]. Metabolism, 2014, 63(1): 9-19

[16]Wong W R, Chen Y Y, Yang S M, et al. Phosphorylation of PI3K/Akt and MAPK/ERK in an early entry step of enterovirus 71[J]. Life Sci, 2005, 78(1): 82-90

[17]Jeong J W, Lee W S, Go S I, et al. Pachymic Acid Induces Apoptosis of EJ Bladder Cancer Cells by DR5 Up-Regulation, ROS Generation, Modulation of Bcl-2 and IAP Family Members[J]. Phytother Res, 2015,7(8):72-76

(王一伊编辑)

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