双组分信号转导系统SrrBA调控表皮葡萄球菌生长和生物膜形成

双组分信号转导系统SrrBA调控表皮葡萄球菌生长和生物膜形成

朱涛,谷生丽

(皖南医学院医学寄生虫学教研室，安徽芜湖241002)

【摘要】目的：探讨双组分信号转导系统SrrBA在表皮葡萄球菌中的调控作用。方法: 利用同源重组技术构建表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株，通过检测OD600值绘制其有氧生长曲线，并观察其厌氧生长状态，微量板半定量方法检测其生物膜形成能力。 结果:经PCR扩增和测序验证获得了表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株(SE 1457-ΔsrrBA)。突变株的生长不论是在有氧还是在厌氧条件下均明显滞后于野生株。此外，突变株形成生物膜的能力较之野生株也显著下降。结论:双组分系统SrrBA可调控表皮葡萄球菌的生长和生物膜形成。

【关键词】双组分信号转导系统；SrrBA；表皮葡萄球菌；生物膜

【文献标识码】【中图号】R 378A

DOI【】10.3969/j.issn.1002-0217.2015.01.004

文章编号：1002-0217(2015)01-0017-05

基金项目：国家自然科学

收稿日期：2014-06-06

作者简介：张巍(1988-)，男，2012级硕士研究生，(电话)13621585705，(电子信箱)sunset_zw@163.com;

通讯作者徐宏光，男，主任医师，教授,(电子信箱)xuhg@medmail.com.cn，.

Two-component signal transduction system SrrBA to regulate bacterial growth and biofilm formation inStaphylococcusepidermidisZHUTao,GUShengli

Department of Medical Parasitology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Abstract【】Objective：To explore the regulatory role of the two-component signal transduction system SrrBA in Staphylococcus epidermidis(S.epidermidis).Methods:Homologous recombination technique was used to generate a srrBA knockout mutant in S.epidermidis 1457 via temperature-sensitive shuttle vector pMAD.Bacterial growth curve was determined by measuring the value of OD600 under aerobic condition,with anaerobic growth being observed.Effect of srrBA mutant on the biofilm formation was measured by a semi-quantitative microtiter plate assay.Results:The knockout mutant was successfully acquired and verified by PCR amplification and sequencing.The mutant exhibited drastically retarded growth compared to the parent strain under either aerobic or anaerobic conditions.Moreover,biofilm formation was significantly reduced in the srrBA mutant.Conclusion:The SrrBA two-component system could regulate bacterial growth and biofilm formation in S.epidermidis.

【Key words】 two-component signal transduction system；SrrBA；staphylococcus epidermidis;biofilm

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双组分信号转导系统(two-component signal transduction systems,TCSs)是细菌感知和响应外界环境变化最主要的调控系统。TCSs由细胞膜上的组氨酸激酶(histidine kinase，HK)蛋白和胞质内具有转录因子活性的反应调节蛋白(response regulator，RR)两部分组成，其编码基因通常前后串联排列形成操纵子。当有外界信号刺激或配体作用于HK的感知结构域时，HK胞内的保守组氨酸残基发生自身磷酸化。随后，被激活的HK与RR的调控区相互作用，将磷酸基团转移到RR的天冬氨酸残基上。磷酸化使RR效应区构象发生改变，可结合DNA序列以激活或抑制靶基因的转录。研究发现它不仅广泛参与细菌的基本生理活动，还与很多病原菌的毒力和致病性密切相关[1-2]。金黄色葡萄球菌双组分信号转导系统SrrBA(staphylococcal respiratory response)响应氧气浓度变化，调节毒力因子分泌和呼吸代谢。另外，研究表明它在厌氧状态下可激活生物膜相关ica操纵子的表达，促进生物膜形成[3-4]。表皮葡萄球菌已成为引发院内感染的前五位病原体之一，在医用材料表面形成生物膜是其致病最主要的毒力因子[5]。尽管基因组有着高度同源性，但已有研究表明表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌采用不同的机制调控生物膜形成[6-8]。目前尚未见对表皮葡萄球菌SrrBA双组分系统的研究报道。因此，本课题拟通过构建srrBA基因敲除突变株研究SrrBA对表皮葡萄球菌生长和生物膜形成的调控作用。

1材料和方法

[5] Otto M.Staphylococcus epidermidis——the ′accidental′ pathogen[J] .Nature reviews,2009,7(8):555-567.

内蒙古锡盟～江苏泰州±800kV特高压直流输电线路天津段自东北向西南区跨越的防洪工程包括金水河、州河、青甸洼蓄滞洪区、漳河、泃河、武河、引泃入潮、潮白新河、青龙湾减河、北运河、北京排污河、龙河、新龙河、永定河泛区、永定河、中泓故道、中亭河、东淀蓄滞洪区、大清河、文安洼蓄滞洪区、子牙河、黑龙港河和贾口洼蓄滞洪区。本文针对以上防洪工程进行评价［1］。

1.2主要试剂和培养基细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA Marker、Pfu DNA聚合酶购自天根生化科技有限公司；溶葡萄球菌素(lysostaphin)和壮观霉素购自Sigma公司；限制性内切酶、DNA连接酶购自Fermentas公司；质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司；LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；红霉素、X-gal、引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；TSB( Tryptic Soy Broth) 为美国BD公司产品；B2培养基成分为：10 g/L 干酪素水解物，25 g/L 酵母提取物，25 g /L 氯化钠，1 g/L 磷酸氢二钾，5 g/L 葡萄糖。

地铁盾构侧穿高速铁路桥梁桩基施工技术与应用…………………………………………………… 常富贵（12-204）

1.3表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株的构建

2014年高考江苏卷优秀作文《书中自有颜如玉》，文中以排比铺陈的形式罗列了李清照、卓文君、王昭君式的青春，无可非议地论证了论点“青春是一种情怀，一种状态”；而后又以杜拉斯80岁时依然自信青春不老一例探寻她身上的青春魅力根源所在。这说明：只要将同类论据组合起来，一样可以使材料熠熠生辉。

2.1同源重组质粒pMAD-ΔsrrBA的鉴定 对从大肠杆菌中提取的重组质粒分别经限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和SmaⅠ、BglⅡ双酶切，结果得到了911 bp的上游同源片段和884 bp的下游同源片段(图1)，表明重组质粒pMAD-ΔsrrBA构建成功。pMAD-ΔsrrBA依次电转金黄色葡萄球菌RN 4220和表皮葡萄球菌1457株，经提取质粒后酶切鉴定均得到了确认。

1.3.2同源重组质粒的构建以表皮葡萄球菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因srrBA上下游的同源片段。其中，以srrUF/srrUR 为引物扩增出911bp含BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点的上游片段，以srrDF/srrDR为引物扩增出884bp含SmaⅠ、BglⅡ 酶切位点的下游片段。上下游同源片段依次克隆至pMAD-spc载体抗性筛选基因spc的两侧，得到同源重组质粒pMAD-ΔsrrBA。所用引物采用Primer Premier 5.0软件设计,具体序列见表1。

表1用于基因敲除突变株构建和验证的PCR引物

Tab 1Primers used in the construction and validation of thesrrBAknockout mutant

PrimersSequence(5'→3')Length(bp)RestrictionsrrUFCGGGATCCTCATCAGCCATCTTGTTCG911BamHⅠsrrURCGGAATTCAACTGTGTGGGGTGTCGGEcoRⅠsrrDFTCCCCCGGGCATACTTTCTACTACCTCCTACA884SmaⅠsrrDRGAAGATCTGGAGAGTCAAATGAGTAAAGAACBglⅡsrrIFGATGACCATGACAATACCACTTC1877spcIRCATCTGTGGTATGGCGGGTAspcIFTGGTTCAGCAGTAAATGGTGG1622srrIRCCTACTACAGAAGAAGATGAAGCA

1.3.3葡萄球菌感受态细胞的制备及电转实验取对数生长早期的6 mL菌液，6 000 g 室温离心10 min。无菌超纯水和10%甘油分别将菌体洗涤两次后，用80 μL的10%甘油重悬即得一份感受态细胞，每份约含1010个细菌。每份感受态细胞中加入10 μg重组质粒DNA，混合均匀后转移至1 mm间隙的电击杯中，进行电击(电转条件：电压2 kV，电容25 μF，电阻100 Ω)。立即加入1 mL B2培养基，并转移至1.5 mL EP管中，30 ℃振荡培养3 h。2 000 g 室温离心5 min后弃上清，菌体重悬于适量的B2培养基中，涂布至含10 μg/mL红霉素的BM平板上，30 ℃温箱培养24～36 h[9]。先将pMAD-ΔsrrBA电转入金黄色葡萄球菌RN 4220中进行限制性修饰，再把经修饰的重组质粒电转入表皮葡萄球菌1457株。

M:Marker III DNA marker;Lane 1:spcfragment plus regions downstream ofsrrBA;Lane 2:Regions upstream ofsrrBAplusspcfragment

式(7)中，由式(6)对广义坐标和局部自由度坐标求偏导得到.考虑折页机构运动副间阻尼的影响，对折页机构采用耗散函数的拉格朗日方程，其表达式为

1.6生物膜半定量检测将过夜培养的表皮葡萄球菌以TSB培养基1∶200稀释，加入96孔培养板(200 μL/孔)，每株菌3复孔，37 ℃分别静置培养12 h和24 h。丢弃菌液，加入PBS(200 μL/孔)洗去未粘附细菌，重复操作3次。加入99%甲醇(200 μL/孔)固定15 min，弃甲醇室温干燥，加入2%结晶紫(200 μL/孔)染色8 min，自来水冲洗培养板至流水无色，干燥后用酶标仪在570 nm波长处测量吸光度值。数据统计学分析采用独立样本t检验，设突变株为实验组，野生株为对照组，P<0.05为有显著差异。

1.4表皮葡萄球菌有氧生长曲线的测定将过夜培养的表皮葡萄球菌接种于含100 mL TSB培养基的1 000 mL锥形瓶中，调节接种量，使得OD600=0.01，置于37 ℃、220 rpm条件下振荡培养，每小时测量一次OD600值并绘制生长曲线。

1.5表皮葡萄球菌厌氧生长状态的观察将过夜培养的表皮葡萄球菌按1∶200接种于厌氧培养基(30 g/L TSB；1.0 g/L半胱氨酸盐酸盐；3 mg/L刃天青钠)，覆盖上液体石蜡油，37 ℃静止培养24 h，观察培养基的浊度变化。

1.3.5基因敲除突变株的鉴定以初筛所得的突变株基因组DNA为模板，采用LA Taq DNA聚合酶，以引物srrIF/spcIR扩增上游同源片段外侧到spc基因的一段序列，以引物spcIF/srrIR扩增spc基因到下游同源片段外侧的另一段序列。反应条件为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，120 s，共30个循环；72 ℃，7min。所用引物具体序列见表1。如果在目的基因srrBA处同源重组成功则能扩增出预期长度的DNA片段。最后对PCR产物进行凝胶回收并测序验证。

2结果

1.3.1表皮葡萄球菌基因组DNA的提取取过夜培养的细菌细胞(至多2×109)，10 000 g 离心1 min，收集菌体，加入2 mg/mL的溶葡萄球菌素37 ℃孵育30 min，按照基因组提取试剂盒方法进行后续操作。

M：D15000 DNA marker；Lane 1：Digested by BamHⅠ and EcoRⅠ；Lane 2：Digested by SmaⅠ and BglⅡ

图1大肠杆菌中重组质粒pMAD-ΔsrrBA酶切鉴定

Fig 1Identification of the recombinant plasmid pMAD-ΔsrrBAinE.coli

2.2表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株的筛选与鉴定在42 ℃的培养温度和50 μg/mL壮观霉素的选择压力下，转化有pMAD-ΔsrrBA的表皮葡萄球菌总共经过5次传代培养，获得了2个菌落呈现白色且对壮观霉素耐药、红霉素敏感的疑似突变株。以同源片段外侧基因序列和spc基因序列设计的两对引物对筛选出的突变株进行PCR扩增，均获得与预期大小一致的片段，分别为1 877 bp和1 622 bp(图2)，且通过测序证实，表明srrBA基因已经成功被spc抗性基因片段所替换。

1.3.4基因敲除突变株的筛选pMAD为温度敏感性质粒，当温度≥40°C时很易丢失；编码β半乳糖苷酶，携带该质粒的葡萄球菌可分解生色底物X-gal致菌落呈现蓝色，而当其从细菌丢失后，菌落则呈现白色。在高温和壮观霉素的压力条件下，质粒pMAD-srrBA将与表皮葡萄球菌基因组发生两次重组，壮观霉素抗性基因将取代srrBA基因，同时质粒也将因复制能力受损而丢失。根据以上原则进行基因敲除突变株的筛选[10]。取3 mL含有pMAD-ΔsrrBA的表皮葡萄球菌菌液接种新鲜300 mL含50 μg/mL壮观霉素的BM培养基，42°C振荡培养24 h；以下同前，共传代5次，每天更换新鲜的含50 μg/mL壮观霉素的BM培养基。取少量菌液接种至含50 μg/mL壮观霉素，20 mg/mL X-gal的TSB平板；挑取单个白色菌落分别接种至含50 μg/mL壮观霉素的和含10 μg/mL红霉素的TSB平板，其中壮观霉素平板上生长、红霉素平板上不生长的菌落为初筛重组成功的srrBA基因敲除突变株，命名为SE1457-ΔsrrBA。

图2基因组PCR鉴定表皮葡萄球菌srrBA突变株

Fig 2Confirmation of SE1457-srrBAby PCR amplication from genomic DNA

2.3表皮葡萄球菌srrBA突变株生长缓慢对srrBA突变株和野生株有氧生长曲线测定的结果显示，培养4 h后，突变株OD600=0.248±0.322，野生株OD600=1.447±0.014(n=3，t=6.445，P=0.003)；培养10 h后，突变株OD600=2.593±0.350，野生株OD600=8.580±0.436(n=3，t=18.524，P=0.000)；突变株的生长明显比野生株迟缓，且突变株无明显的对数生长期(图3)。对它们在厌氧条件下的生长状态进行进一步观察，结果显示经过24 h的培养，野生株的菌液已比较浑浊，而突变株的菌液看上去还很清亮，表明srrBA突变既抑制了表皮葡萄球菌的有氧生长也抑制了其厌氧生长(图4)。

图3表皮葡萄球菌srrBA突变株和野生株的有氧生长曲线

Fig 3Growth curves of SE1457-srrBAand its parent strain under aerobic condition

2.4表皮葡萄球菌srrBA突变株生物膜形成能力下降采用微量板半定量法对srrBA突变株的生物膜形成能力进行检测，结果显示，培养12 h后，突变株OD570=0.287±0.042，野生株OD570=1.172±0.111(n=3，t=12.903，P=0.000)；培养24 h后，突变株OD570=1.117±0.119，野生株OD570=2.048±0.152(n=3，t=-8.335，P=0.001)；突变株的生物膜形成能力均明显低于野生株(图5)。

图4表皮葡萄球菌srrBA突变株和野生株的厌氧生长状态

Fig 4Anaerobic growth of SE 1457-srrBAand its parent strain

aS.epidermidisbiofilm was cultured in 96-well polystyrene plates and stained with crystal violet under aerobic condition;B.Biofilm density was semi-quantified by the value of OD570.One of at least three independent experiments was shown.Data represent mean±SD;**P<0.01(ΔsrrBAversus WT)

图5表皮葡萄球菌生物膜的微量板半定量法检测

Fig 5Detection ofS.epidermidisbiofilm by a semi-quantitative microtiter plate assay

3讨论

在枯草芽孢杆菌中，SrrBA的同源蛋白是双组分信号转导系统ResDE。枯草芽孢杆菌ResDE是其有氧和厌氧代谢重要的整体调控子[11]。金黄色葡萄球菌SrrBA根据氧气浓度变化，调控RNAⅢ、TSST-1、蛋白A和PIA等毒力因子的表达[3]。而SrrBA在表皮葡萄球菌中的调控作用仍然未知。本研究基于同源重组的原理，利用穿梭质粒pMAD成功构建了表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株，为下一步的功能研究奠定了基础。

表皮葡萄球菌srrBA突变株有氧生长和厌氧生长都明显滞后于野生株，与枯草芽孢杆菌resDE突变后的生长状态相符，而与大多数金黄色葡萄球菌srrBA突变株有氧生长无变化的结果不符。已有研究表明枯草芽孢杆菌中ResDE既调控氧化呼吸链上的细胞色素氧化酶caa3和aa3，也调控厌氧调控子Fnr、硝酸盐还原酶nasDEF[11]。而在金黄色葡萄球菌srrBA突变株中则主要是参与发酵的关键酶如乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶在有氧和厌氧条件下表达均下调[12]。因此，srrBA突变导致的有氧生长状态的不同可能是由于不同菌种遗传组成不同所致。srrBA突变株的生物膜形成能力在有氧状态下也显著降低。金黄色葡萄球菌通常只有在厌氧的条件下才会形成生物膜，而表皮葡萄球菌不论是在有氧还是在厌氧条件下均能形成生物膜[13]。因此，研究金黄色葡萄球菌SrrBA激活ica操纵子的实验是在厌氧条件下开展的，而我们的结果则提示了不论是在有氧还是厌氧条件下SrrBA均可能通过激活ica操纵子促进生物膜形成。

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食品产业在国内有一些品牌，但可持续发展的品牌不多，国际品牌更少。品牌是一个企业的有形资产和无形资产的综合体，是价值和信任的“航空母舰”，所以食品产业在今后发展中要更加重视品牌建设。

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1.1菌株和质粒表皮葡萄球菌1457株、大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球菌RN 4220株由本教研室保存，穿梭质粒pMAD-spc由法国巴斯德研究Débarbouillé教授惠赠。

选择120个因正畸减数而新鲜拔除的第一前磨牙，要求牙冠完整、无龋损、无色素、无脱矿、无裂纹。去除牙周附着组织，在无菌去离子水冲洗下用单面片切砂条抛光唇面后，将冠部制备成3 mm×3 mm×2 mm的釉质块，共制作釉质样本120个；所有样本除唇侧釉质面外，其余牙面均涂上抗酸指甲油。随机抽取其中60个样本，在唇侧釉质面上涂布酸蚀剂30 s，然后用大量去离子水冲洗后，吹干至釉质表面呈白垩色，用于釉质再矿化实验；其余60个釉质样本不予处理，用于釉质保护实验。

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我院处方为电子打印处方，避免了传统纸质处方因书写潦草、字迹难认给药师审核调配带来的困难，也减少了处方前记、正文、后记内容缺项及书写不规范的情况，但处方用药的合理性问题依然存在。

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土地利用分级是将土地利用程度按照土地自然综合体在社会因素影响下的状况分成若干级［11］。中国资源环境数据库中，从生态学角度将土地利用分级定义为4级，如表2所示。

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