造血干细胞移植后人巨细胞病毒感染的相关性研究

造血干细胞移植后人巨细胞病毒感染的相关性研究

戴艳1，方芳2，冯钢2，苏贵平1，黄来全1，蒋艺枝1，黄东平1

(皖南医学院附属弋矶山医院1.血液内科；2.检验科，安徽芜湖241001)

【摘要】目的：探讨分析造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)后人巨细胞病毒(HCMV)感染与更昔洛韦(ganciclovir,GCV)耐药的发生及与移植类型、移植物抗宿主病(GVHD)等的相关性。 方法: 2012年3月～2014年4月在我院接受HSCT的患者18例，采用FQ-PCR法监测HCMV-DNA水平。HCMV-DNA阳性患者给予GCV抢先治疗。 结果: 8例患者发生HCMV感染 (44.4%)，其中7例为不全相合无关供体脐血造血干细胞移植(UCBT)者。发生HCMV感染的8例患者中有7人出现GVHD，其中出现Ⅲ度及以上GVHD有5例(71.4%)，均为UCBT者。GCV耐药2例，均为UCBT后。 结论： UCBT患者HCMV感染及GCV耐药高，GVHD与HCMV感染有关。

【关键词】造血干细胞移植；人巨细胞病毒；更昔洛韦

【文献标识码】【中图号】R 457.7A

DOI【】10.3969/j.issn.1002-0217.2015.01.010

文章编号：1002-0217(2015)01-0039-04

收稿日期：2014-02-25

作者简介：全斌(1989-)，男，2012级硕士研究生，(电话)18305539343，(电子信箱)quanbin417@126.com；

Human cytomegalovirus infection and hematogenic stem cell transplantationDAIYan,FANGFang,FENGGang,SUGuiping,HUANGLaiquan,JIANGYizhi,HUANGDongping

Department of Hematology,Yijishan Hospital,Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

Abstract【】Objective：To investigate the incidence of cytomegalovirus(CMV) infection and ganciclovir(GCV) resistance after hematopoietic stem cell transplantation(HSCT),and the correlation between CMV infection and graft-versus-host disease (GVHD).Methods:Eighteen patients undergone HSCT in our hospital were included between March 2012 and April 2014.Real-time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR) was performed to test the CMV infection in total patients,and patients with positive CMV-DNA were treated with GCV.Results:CMV infection occurred in 8 patients (44.4%),in whom 7 were umbilical cord blood transplantation(UCBT) from unrelated donors(87.5%,7/8).Seven in 8 with CMV infection were complicated with GVHD,in which 5 were infection of grade Ⅲ or over(71.4%,5/7).GCV resistance after UCBT occurred in 2.Conclusion:HCMV infection and GCV resistance appear higher in patients after UCBT,and incidence of GVHD is associated with HCMV.

【Key words】 hematopoietic stem cell transplantation;cytomegalovirus;ganciclovir

造血干细胞移植(HSCT)是治疗白血病、恶性肿瘤、遗传性疾病等的重要手段之一，被誉为医学发展史上的一个里程碑。HSCT成败的关键取决于移植相关并发症的发生。人类巨细胞病毒(HCMV) 感染是造血植入后最常见的病毒感染之一，也是对HSCT 患者威胁最大的一种病毒。HSCT后约60%～70%受者出现活动性人巨细胞病毒(HCMV)感染，HCMV相关病死率为46%，居移植病死率首位[1-2]。本项目以HSCT患者为研究对象，采用FQ-PCR方法监测HSCT患者血HCMV-DNA，HCMV-DNA阳性患者给予更昔洛韦(ganciclovir,GCV)抢先治疗，综合分析移植类型、GVHD等与HCMV感染的相关性，为HSCT患者HCMV感染早期诊断和早期治疗提供理论与实验基础，为改进治疗方案，创立新的防治措施提供新思路。

1资料与方法

1．1临床资料18例均为2012年3月～2014年4月在我院接受HSCT患者，男性9例，女性9例，中位年龄38岁(19～51岁)。其中急性髓细胞白血病5例(包括2例难治复发性白血病)，急性淋巴细胞白血病3例，慢性粒细胞白血病急性变1例，非霍奇金淋巴瘤5例，多发性骨髓瘤1例，再生障碍性贫血2例，阵发性睡眠性血红蛋白尿1例。移植类型：接受同胞全合异基因外周血HSCT者3例，接受同胞全合异基因骨髓+外周血HSCT者1例，接受单份不全相合无关供体脐血HSCT者7例，双份不全相合无关供体1例，自体造血干细胞移植6例。所有HSCT移植治疗方案均经医院伦理委员会器官移植分会评审通过。所有患者均签署知情同意书。

1．2HCMV-DNA检测FQ-PCR方法检测外周血HCMV-DNA：抽取静脉血2 mL，分离出0.2 mL血清；溶血标本重新取样。处理血清：血清50 μL，加入50 μL核酸提取液，振荡10 s，99 ℃干浴，13 000 r/min离心10 min，保留上清备用。阴性血清对照品及临界阳性对照品同上处理。试剂配制：取n×36 μL HCMV核酸荧光PCR检测混合液与n×0.4 μL酶(Taq+UNG)(n为反应管数)，振荡混匀数秒，3 000 r/min离心数秒。加样：取上述混合液36 μL置于PCR反应管中，然后将试剂盒内HCMV-DNA阴性血清对照品、血清样本、HCMV-DNA临界阳性对照品处理上清液及HCMV-DNA标准品各4 μL分别加入PCR反应管中，盖好反应管盖，立即进行PCR扩增反应。PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR上，设置循环参数：37 ℃×2 min；94 ℃×2 min；循环一次，再按93 ℃×15 s至60 ℃×1 min，循环40次；单次荧光检测在60 ℃，反应体系为40 μL。选用FAM荧光通道，设定好基线和阈值。实验结束后将HCMV-DNA定量标准品浓度输入仪器软件中，数据分析，仪器生成标准曲线，之后自动显示待检样品定量值。

1.3HCMV-DNA的监测及治疗异基因HSCT，移植前供受者血HCMV-DNA，移植后受者每周1次监测HCMV-DNA，+60 d每2周1次至移植后+100 d。高危患者至移植后+270 d。自体HSCT在+20 d～+60 d每周监测HCMV-DNA。HCMV-DNA阴性不预防用药；受者如果HCMV-DNA阳性立即给予GCV静脉注射，10 mg/(kg·d)。如果连续2周HCMV-DNA持续上升，或HCMV-DNA拷贝数下降呈低水平，而后又反跳上升，临床症状没有改善或消除，均诊断为HCMV临床耐药。换用磷甲酸钠治疗，并且每周监测2次直至连续2次结果转为阴性后停药。

1.4GVHD的预防环孢素/霉芬酸酯(CSA/MMF)，CSA 3 mg/(kg·d),持续静滴，-1 d开始；MMF 25～30 mg/(kg·d)，口服，+1 d开始。

2结果

2.1HCMV感染发生情况18例HSCT患者中有8例发生HCMV感染(44.4%)，其中不全相合无关供体脐血HSCT者7例，同胞全合异基因骨髓+外周血HSCT者1例。1例无关供者脐血HSCT患者HCMV相关性出血性膀胱炎，患者出现肉眼血尿，伴有尿频、尿痛等刺激症状，血、尿HCMV-DNA检测值均为阳性，并且尿中拷贝数大于血液，结合临床诊断为HCMV相关出血性膀胱炎。本组患者首次HCMV感染发生的中位时间为+42 d(+27～+62 d)，初始中位HCMV-DNA拷贝数为2.41E+03 (1.21 E+03～4.91 E+06)/mL。

2.2HCMV感染的治疗及转归8例HCMV感染患者给予GCV标准量抢先治疗，7例患者HCMV感染治愈，1例为双份无关供者脐血HSCT患者，于+41 d出现Ⅲ度GVHD，+62 d测HCMV-DNA拷贝数高达4.91 E+06/mL，+75 d患者血小板未植入，GVHD未控制，放弃治疗死亡。

共有2例患者诊断为GCV耐药，其中1例为高危急性淋巴细胞白血病患者，行无关供者脐血HSCT，移植过程中出现Ⅲ度GVHD，继之HCMV感染(图1)，给予GCV标准量治疗2周后，HCMV-DNA拷贝数上升(图2)，考虑HCMV耐药，更换磷甲酸钠治疗后临床症状好转，HCMV-DNA拷贝数下降至正常，HCMV感染治愈，但患者GVHD反复加重，+251 d死于慢性广泛性GVHD，肺部感染。另1例难治性白血病的患者行地西他滨桥联无关供体脐血HSCT挽救性治疗，在脐血植入后出现HCMV-DNA拷贝数上升，GCV标准量治疗1周后，HCMV-DNA拷贝数下降呈低水平，继之又反跳上升，诊断HCMV耐药，更换磷甲酸钠治疗后治愈。

图11例无关供者脐血HSCT患者植入后HCMV感染

Fig 1Positive HCMV-DNA in UCBT from unrelated donors

2.3HCMV感染与HSCT后GVHD发生的关系发生HCMV感染的8例患者中有7人出现GVHD，其中出现Ⅲ度及以上GVHD有5例(71.4%)，均为UCBT者。HCMV-DNA阳性和阴性者发生GVHD差异有统计学意义(等级相关系数，rs=0.892,P<0.01)。

图2GCV治疗2周后的HCMV-DNA

Fig 2HCMV-DNA after 2-week of GCV treatment

表1HCMV感染与HSCT后GVHD的发生

Tab 1HCMV infection and GVHD incidence after HSCT

GVHDHCMV+-合计+707-11011合计81018

3讨论

造血干细胞移植中，免疫重建延迟、移植物抗宿主病(GVHD)的发生或预防GVHD的免疫抑制剂等均可造成HCMV隐性感染激活，引起一系列HCMV感染性疾病，还可诱导GVHD的发生，影响造血干细胞的植入，降低移植成功率[3-4]。HSCT患者发生CMV感染的可能因素有①预处理方案：有报道认为预处理接受TBI是CMV感染的危险因素[5]；②移植类型：非血缘及单倍体相合供者移植是CMV感染的危险因素，考虑可能与非血缘及单倍体相合供者移植预防GVHD方案中使用了大量免疫抑制剂尤其是ATG有关[6]；③HLA配型情况：HLA配型不全相合移植患者容易发生CMV活动性感染，由于HLA配型不全相合移植，患者预处理导致患者的细胞免疫功能低下，而细胞免疫是机体防御CMV感染过程的主要机制；④输血的次数可增加CMV感染的发生率；⑤aGVHD可明显损害患者的正常免疫功能，同时由于治疗aGVHD要应用大量的免疫抑制剂，进一步损害了患者的免疫力而造成CMV的激活[7]。我们采用RQ-PCR技术监测外周血CMV-DNA并动态监测其拷贝数的变化。本组18例患者中，总体HCMV感染率44.4%，无关供者脐血HSCT患者HCMV感染率为87.5%。自体造血干细胞无1例出现HCMV感染。临床上在抗病毒治疗HCMV感染同时，多合并撤减免疫抑制剂的综合治疗方法，虽然提高了机体对HCMV的免疫力，但同时也增加了GVHD发生的危险。寻找防治GVHD的免疫抑制剂的撤减与继发HCMV感染及耐药的平衡点是治疗造血干细胞移植后并发症的难点。

GCV 是免疫抑制患者HCMV感染的一线治疗药物。GCV进入感染细胞即被病毒蛋白激酶(UL97的编码产物)磷酸化为一磷酸GCV，随后又被磷酸化为三磷酸GCV，后者可竞争性结合HCMV-DNA 多聚酶的结合位点而掺入病毒DNA链，减慢和终止链的延长，是病毒DNA多聚酶的有效抑制剂。但仍有患者GCV治疗后出现HCMV感染恶化、移植物排斥。本组2例诊断为GCV耐药者均为UCBT后。有报道认为HSCT后HCMV耐药可能与UL97、UL54突变相关[8-9]。我们将继续积累更多病例资料，通过对HSCT患者的HCMV感染及耐药性的相关性研究，为HSCT患者HCMV感染和耐药早期诊断和早期治疗提供理论与实验基础，以期及时改进治疗方案。

【参考文献】

[1] Milano F,Pergam SA,XIE Hu,etal.Intensive strategy to prevent CMV disease in seropositive umbilical cord blood transplant recipients[J] .Blood，2011,118(20):5689-5696.

[2] Hatzimichael E ，Tuthill M.Hematopoietic stem cell transplantation[J] .Stem Cells Cloning，2010,3:105-117.

[3] El-Cheikh J,Devillier R,Crocchiolo R,etal.Impact of Pretransplant Donor and Recipient Cytomegalovirus Serostatus on Outcome for Multiple Myeloma Patients Undergoing Reduced Intensity Conditioning Allogeneic Stem Cell Transplantation[J] .Mediterr J Hematol Infect Dis，2013,5(1):e2013026.

[4] Zawilinska B,Kopec J,Szostek S,etal.Lymphotropic herpesvirus DNA detection in patients with active CMV infection - a possible role in the course of CMV infection after hematopoietic stem cell transplantation[J] .Med Sci Monit，2011,17(8):CR432-CR441.

[5] Yi ES，Kim YJ.Cytomegalovirus Infection according to Cell Source after Hematopoietic Cell Transplantation in Pediatric Patients[J] .Yonsei Med J,2012,53(2):393-400.

[6] Nakamae H,Kirby KA,Sandmaier BM,etal.Effect of Conditioning Regimen Intensity on CMV Infection in Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation[J] .Biol Blood Marrow Transplant，2009,15(6):694-703.

[7] 李欲航,徐晨,陈健琳，等.异基因造血干细胞移植后人CMV感染与GVHD相关性的临床研究[J] .中国器官移植杂志,2013,34(2):84-86.

[8] Chou S，Bowlin TL.Cytomegalovirus UL97 Mutations Affecting Cyclopropavir and Ganciclovir Susceptibility[J] .Antimicrob Agents Chemother,2011,55(1):382-384.

[9] Gilbert C,Azzi A,Goyette N,etal.Recombinant Phenotyping of Cytomegalovirus UL54 Mutations That Emerged during Cell Passages in the Presence of either Ganciclovir or Foscarnet[J] .Antimicrob Agents Chemother,2011,55(9):4019-4027.

·临床医学·

喻艳林，女，主任医师，副教授，硕士生导师，(电子信箱)yuyanlin1104@sohu.com，通讯作者.