流式细胞仪与显微镜联合检测MRD的临床价值

2016-01-11李凤,蒲泽晏,刘方久等

西部医学 2015年8期

流式细胞仪与显微镜联合检测MRD的临床价值*

李凤1蒲泽晏1刘方久2唐雪梅3魏容1梁艳丽1王欣3冯簏洁1

(遂宁市中心医院1.检验科，2.基础实验室，3.血液科，四川遂宁629000)

【摘要】目的了解流式细胞仪与显微镜联合检测微小残留白血病细胞(MRD)的临床价值。方法采集已确诊的白血病患者65例经化疗完全缓解(CR)后的骨髓，同时用四色多参数流式细胞仪和奥林巴斯显微镜做MRD检测共233次，检测急性白血病患者完全缓解后治疗过程中不同时间点的MRD。结果65例急性白血病患者诱导治疗缓解达CR后的233次MRD检测中，流式细胞仪MRD检测阳性率为55.4%(129/233例)；显微镜FAB形态学方法检测阳性率为35.63%(83/233例)。流式细胞仪MRD监测的阳性率明显高于显微镜FAB形态学检测，两种方法结果比较，差异有统计学意义(P<0.01)；233次MRD检测中59次显微镜形态学检测阴性而流式细胞仪检测阳性，13次显微镜检测阳性而流式细胞仪检测阴性。结论用四色多参数流式细胞仪能快速有效地对急性白血病患者进行MRD检测；用流式细胞仪与显微镜联合检测MRD，可避免因白血病细胞在治疗过程中某些标志丢失或改变而造成MRD假阴性，进一步提高MRD阳性检出率，对于提高急性白血病患者的生存率及生存质量和疗效评估及预后监测都具有重要意义。

【关键词】微小残留白血病细胞；急性白血病；流式细胞术；显微镜

【中图分类号】R 446.8【文献标志码】A

基金项目：遂宁市科技计划项目(09M013)

收稿日期：( 2014-08-28；编辑：母存培)

Clinical application evaluation of MRD monitoring with flow cytometry and microscopeLI Feng1, PU Zeyan1, LIU Fangjiu2,etal

(1.ClinicalLaboratory,CentralHospitalofSuining,Suning629000,Sichuan;

2.BasicLaboratory,CentralHospitalofSuining,Suining629000,Sichuan;

3.DepartmentofHematology,CentralHospitalofSuining,Suining629000,Sichuan)

Abstract【】ObjectiveTo find the clinical value of the minimal residual disease (MRD) with flow cytometry and microscope. MethodsWe collected marrow from the 65 patients who complete remission after chemotherapy and detected the MRD levels for 223 times in the therapy progress with four-color multiparameter flow cytometry and OLYMPUS microscope. ResultsThe positive rate of MDR detected with flow cytometry was 55.4%(129/233). The positive rate of MDR detected with microscope was 35.63%(83/233). The positive rate of MDR detected with flow cytometry was significant higher than that detected with microscope. The difference was considered statistically significant(P<0.01). 59 cases were MDR position detected with flow cytometry but negative with microscope. 13 cases were MDR negative detected with flow cytometry but positive with microscope. ConclusionWith four-color multiparameter flow cytometry, we could monitor the MDR level of patients with acute leukemia quickly and effectively. United monitoring with flow cytometry and microscope could avoid the false negative because of biomarker change and improve the detection rate of MDR. It is meaningful for improving the survival rate and quality of life of patients with acute leukemia, evaluating of curative effect and monitoring the prognosis.

【Key words】Minimal residual disease; Acute leukemia; Flow cytometry; Microscope

1材料与方法

1.1一般资料选择我院血液科2012年1月1日~2013年12月31日住院的、经奥林巴斯显微镜FAB细胞形态学和细胞化学染色及四色流式细胞仪免疫学分型确诊为急性白血病患者65例，分别为AML-M1 4例、AML-M2 13例、AML-M3 15例、AML-M4 3例、AML-M5 12例、AML-M6 2例、ALL 16例，其中男39例，女26例，年龄3~75岁，平均35岁。在急性白血病化疗1个月经FAB诊断标准完全缓解后，分别在缓解期不同维持治疗期行骨髓复查时同时做流式细胞计数分析和显微镜FAB形态学MRD检查，总共233次。

1.2仪器和试剂所用仪器为美国BD公司生产的FACSCalibur四色多参数流式细胞仪和日本奥林巴斯公司生产的OLYMPUS BX51高清显微镜；试剂单克隆抗体为BD公司生产的原装配套试剂，组织化学染色试剂由上海太阳生物技术有限公司生产提供，瑞姬氏染色液由实验室自配。

1.3检测方法采集已确诊的急性白血病患者并经化疗达完全缓解后的骨髓做MRD检查，同时采用四色多参数流式细胞仪和奥林巴斯显微镜检测，监测急性白血病患者完全缓解后的治疗过程中不同时间点的微小残留白血病细胞。首先采集约0.2ml骨髓用于直接涂片染色做显微镜FAB形态学检测，并分类计数原始细胞的比率。接着采集约1~2ml骨髓置于含肝素的真空采血管内颠倒混匀，用于做流式细胞计数及单克隆抗体检查，分析有无细胞表型异常及原始细胞比率增高。操作按仪器使用说明书规范化操作，并严格执行SOP文件。

1.4判定标准用四色多参数流式细胞分析仪做荧光标记检测分析，在细胞筛选时白血病细胞出现的区域内有细胞存在，即判断为MRD阳性。以这类细胞占骨髓单个细胞总数的比率作为MRD的测定值。流式细胞仪检测MRD<0.01%为阴性，≥0.01%或表型异常为阳性。显微镜FAB形态学检查标准：参照《血液病诊断及疗效标准》判断[6]。

1.5统计学处理用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

对233次流式细胞仪与显微镜同时检测MRD的结果见表1。表1显示，流式细胞仪检测MRD的阳性率明显高于显微镜FAB形态学检测，差异有统计学意义(P<0.01)。本研究发现，233次MRD检测中59次显微镜FAB形态学检测阴性，而四色多参数流式细胞仪检测阳性；13次显微镜FAB形态学检测阳性而四色多参数流式细胞仪检测阴性。提示二者联合检测，可进一步提高微小残留白血病细胞阳性检出率。

表1流式细胞仪与显微镜检测MRD结果比较

Table 1The comparison of MRD detected by flow cytometry and microscope

组别次数MRD检出次数(×10-2)流式细胞仪233129(55.4)显微镜23383(35.6)χ218.312P<0.01

3讨论

流式细胞仪的检测原理就是对细胞及其他生物颗粒进行多参数分析，是一种可对特定的细胞群加以分选的细胞定量分析新技术；是单克隆抗体技术、激光技术、及电子计算机技术的综合应用。其特点就是可以在几秒钟内分析数万个细胞，快速准确地对每个细胞进行多参数定量分析，四色多参数流式细胞仪还可以识别1个细胞上同时存在多种抗原。MRD的流式细胞仪检测就是根据急性白血病患者初诊时白血病细胞免疫分型表型特征，分别采用不同的单克隆抗体组合，检测经诱导化疗完全缓解后的骨髓MRD水平变化[7]。本研究提示应用四色多参数流式细胞仪可以发现急性白血病完全缓解后显微镜FAB形态学检测不到的白血病细胞，尤其是AML-M5和ALL型微小残留白血病细胞。流式细胞仪的优势就是可以在很短时间内分选大量特定的细胞群，检测表型异常的白血病细胞，也就是从白血病细胞表型异常进行诊断，从而将急性白血病的缓解标准从细胞学水平提高到了免疫学水平。因此，应用四色多参数流式细胞仪检测方法发现这种潜在的白血病细胞，并且进行定量分析检测，有助于临床急性白血病患者的早期诊断和早期治疗，从而提高患者的生存率及生存质量。

流式细胞仪的检测虽然速度更快，更经济适用，但在部分患者中由于缺乏表面膜抗原标记而使其应用受到限制，因此流式细胞仪也有它的局限性[8]。本研究发现，显微镜FAB形态学检测83次阳性者中，四色多参数流式细胞仪检测为阴性者13次(15.66%)，其原因，可能为患者缺乏表面膜抗原标记或骨髓标本采集量过大而被稀释所致。由此可见，流式细胞仪与显微镜联合监测MRD可取长补短，进一步提高微小残留白血病细胞阳性检出率；避免因白血病细胞在治疗过程中某些标志丢失或改变而造成MRD假阴性[9-11]。对于MRD检测阳性的急性白血病患者必须密切监测MRD的变化，采用连续定期监测和动态观察的方式，以保证急性白血病患者及时治疗并清除MRD，对降低急性白血病的复发率、达到个体化治疗及治愈的目的具有十分重要的临床意义[12]。

（1）克里氏艾美耳球虫。卵囊呈典型的卵圆形，平均为40μm×21μm，形状指数为1.904。卵囊囊壁外层光滑、色泽淡黄，内层为褐黄色，有卵膜孔，有极帽，孢子囊为宽卵圆形，有内残体，斯氏体不明显或无，没有外残体，有1个或多个极粒，孢子化时间约60 h。

4结论

用四色多参数流式细胞仪检测MRD，能快速有效地对急性白血病患者进行MRD检测；但是用流式细胞仪与显微镜联合检测MRD，可避免因白血病患者由于表面膜抗原标记缺乏或白血病细胞在治疗过程中某些标志丢失或改变，或骨髓标本采集时过度稀释等造成MRD假阴性，进一步提高MRD阳性检出率，对提高急性白血病患者的生存率及生存质量和疗效评估及预后监测都具有重要意义。

【参考文献】

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