靶向大鼠PALM3基因的RNA重组腺病毒载体构建及鉴定

靶向大鼠PALM3基因的RNA重组腺病毒载体构建及鉴定*

付玉梅1陈旭昕2韩志海1,2

(1.安徽医科大学海军临床学院， 北京 100037; 2.海军总医院呼吸科， 北京 100037)

【摘要】目的构建靶向大鼠paralemmin-3(PALM3)基因的短发夹shRNA(RNA)重组腺病毒载体，干扰大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AE2 cells)中PALM3的表达。方法设计大鼠靶向PALM3基因的shRNA，插入穿梭质粒pGV120-EGFP，行PCR、测序鉴定；将穿梭质粒和骨架质粒共转293细胞，进行重组腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP的包装，并采用TCID50法测定病毒感染滴度；用此病毒感染大鼠AE2细胞，Western blot法检测细胞内PALM3蛋白表达。结果穿梭质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP经PCR及测序鉴定证实构建成功，进一步构建了表达大鼠PALM3基因shRNA的重组腺病毒载体Ad-palm3-shRNA-EGFP，重组腺病毒感染滴度为3× 1010 pfu/mL，感染大鼠AE2细胞后显著抑制目的蛋白表达(P<0.05)。结论本实验成功构建了针对大鼠PALM3基因的shRNA重组腺病毒，显著下调了大鼠AE2细胞中PALM3的表达，为进一步探索PALM3在炎性失控性疾病中的作用奠定基础。

【关键词】短发夹RNA； paralemmin-3； 重组腺病毒载体； RNA干扰； 急性肺损伤

【中图分类号】R 383.1+6【文献标志码】A

基金项目：国家自然科学基金(81300050)，海军总医院创新培养基金(CXPY201417)。

通讯作者：韩志海，医学博士，副主任医师，Tel：18600310135， E-mail：zhihaihandoctor@163.com。

收稿日期：( 2015-05-14； 编辑： 张文秀)

Construction and identification of recombinant adenovirus expressing short hairpin RNA of rat paralemmin-3FU Yumei1, CHEN Xuxin2, HAN Zhihai1,2

(1.NavyClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity,Beijing100037,China;

2.DepartmentofRespiratoryMedicine,NavyGeneralHospital,Beijing100037,China)

Abstract【】ObjectiveTo construct the recombinant adenovirus vector (Ad.V) of short hairpin RNA (shRNA) against rat paralemmin-3 (PALM3) gene and identify the effects of down-regulation of recombinant Ad.V in rat alveolar epithelial 2 cells (AE2 cells). MethodsThe short hairpin oligonucleotide and complementary strand targeting the consensus sequences of PALM3 were designed and inserted into the shuttle plasmid pGV120-EGFP. The pGV120-palm3-shRNA-EGFP was identified by PCR and DNA sequencing. Recombinant viruses were generated by using 293 packaging cells co-transfected with the shuttle plasmid and the framing plasmid. The titer of Ad-palm3-shRNA-EGFP was determined by means of 50% tissue culture infectious dose. And then the recombinant adenovirus Ad-palm3-shRNA-EGFP was used to infect the rat AE2 cells and the protein expression of PALM3 was detected by Western blot. ResultsThe PCR and DNA sequencing results demonstrated that the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP was successfully constructed. Cytopathic effect and fluorescence detection indicated that the adenovirus was successfully packaged after co-transfection. The titer of Ad-palm3-shRNA-EGFP was 3×1010 pfu/mL. The PALM3 protein expression in the rat AE2 cells was significantly decreased. ConclusionThe recombinant adenovirus vectors target to rat PALM3 are successfully constructed and packaged and it could obviously knockdown the expression of PALM3 in the rat AE2 cells, which offers a basis for further research on the role of PALM3 in inflammatory diseases.

【Key words】Short hairpin RNA; Paralemmin-3; Recombinant adenovirus; RNA interfering; Acute lung injury

共同第一作者：陈旭昕

Paralemmin-3 (PALM3)属于Paralemmin蛋白家族，可能作为“接头”分子参与Toll样受体/白介素-1受体(Toll like receptor/Interleukin-1 receptor, TIR)信号通路转导，且与TIR信号通路中的负性调控分子单免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关蛋白存在相互作用[1,2]。我们的前期研究发现，下调PALM3的表达可减轻人肺泡上皮细胞对LPS诱导的炎症反应，其机制可能与阻断TIR信号转导而降低核转录因子-κB的活性有关[3]。深入研究PALM3在TIR信号通路中的作用及机制，有望为急性肺损伤等炎症失控性疾病寻找到新的治疗靶点。RNA干扰(RNA interfering, RNAi)是近年发展迅速的一项生物技术，已成为基因功能研究和基因治疗的强有力工具[4]。本研究旨在以短发夹RNA(short hair RNA, shRNA)腺病毒为介导，构建靶向大鼠PALM3基因的表达载体，为后继研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料 DH5α感受态菌株及293细胞株由本室保存，大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell，AEC) Ⅱ型AEC购自武汉普诺赛生命科技有限公司；pGV120载体及空腺病毒载体Ad-EGFP均购自上海吉凯基因化学技术有限公司；DMEM、Ham’F12 细胞培养基及新生胎牛血清购自Gibco公司，Opti-MEM培养基、脂质体转染试剂盒及Trizol购自Invitrogen公司；PCR试剂、DNA连接试剂盒、内切酶EcoRⅠ和AgeⅠ购自Takara公司，胶回收及DNA纯化试剂盒购自上海生工有限公司，引物合成及AdMax腺病毒包装系统购自加拿大Microbix公司；抗PALM3多克隆抗体均购自Santa cruz公司；GAPDH抗体、ECL-PLUS发光试剂盒、蛋白定量和细胞总蛋白提取试剂盒均为江苏碧云天公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养293细胞用于包装和扩增腺病毒，用含有10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，大鼠Ⅱ型AEC 细胞用含10%胎牛血清的Ham's F12 培养基在37.0℃、5% CO2及95%湿度条件下培养，隔天换液，实验用细胞均处于对数生长期。

1.2.2大鼠PALM-3基因特异性shRNA靶序列的选择及合成针对Genebank中大鼠PALM3基因的序列(Gene ID: 100359592)，按照RNAi序列设计原则，选择AGATCTTGATGGAGGGTTT为干扰靶序列，由上海吉凯基因化学技术有限公司设计并合成含干扰序列的引物。退火形成双链DNA oligo，在其两端连接上EcoRⅠ和AgeⅠ酶切位点粘端，并BLAST同源性分析。由上海吉凯基因化学技术有限公司合成寡核苷酸序列，正义链为5′CCGGGGAGATCTTG ATGGAGGGTTTCTCGAGAAACCCTCCATCAAG ATCTCCTTTTTG3′，反义链为5′AATTCAAAAA GGAGATCTTGATGGAGGGTTTCTCGAGAAAC CCTCCATCAAGATCTCC3′。

1.2.3穿梭质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP构建用EcoRⅠ和AgeⅠ双酶切穿梭质粒pGV120，酶切产物纯化后，用DNA连接酶连接线性化的pGV120及退火后的双链DNA，转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养板上过夜，挑选单克隆扩大培养，行PCR检测，PCR反应的上游引物：5′CCATGATTCCTTCATATTTGC3′，下游引物：5′GAGGCCAGATCTTGGGTG3′；对PCR鉴定正确的阳性克隆小提质粒并送检测序。

1.2.4重组腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP制备及滴定测定按Lipofectamine 2000脂质体说明书将骨架质粒pBHGlox_E1, 3Cre和上述穿梭质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP共转染293细胞，24 h后观察EGFP表达，培养10 d后在显微镜下观察细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)，当细胞中出现CPE且视野中局部或全部为绿色荧光时，表明重组腺病毒包装成功。当90%以上细胞出现CPE时收集细胞，反复冻融3次，裂解细胞并收集病毒上清，用所收集的上清再感染293细胞进行病毒扩大生产与纯化。经离子交换及过筛纯化后，病毒液保存于-70℃冰箱中备用；制备1×105/mL的293细胞悬液，100μl/孔接种至96孔板，将病毒液从1×1011稀释度开始进行8个稀释梯度的稀释并转染细胞，每个稀释度设9个复孔，并设立阴性对照，常规孵育10天，记录细胞CPE情况。

1.2.5Western blot检测Ad-palm3-shRNA-EGFP感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞内PALM3蛋白表达制备大鼠Ⅱ型AEC悬液，以3×105/孔接种到6孔板，细胞融合度达60~70%时，弃培养液加入病毒液Ad-palm3-shRNA-EGFP或Ad-EGFP(对照)1 mL/well到6孔板(MOI = 50)。90 min后加入20%FBS完全培养基至终体积2 mL，孵育48h。按碧云天公司细胞总蛋白提前试剂盒操作说明书，提前细胞的总蛋白，经测定蛋白浓度后，取25 μl样品行SDS-PAGE电泳,电转至PVDF膜, 脱脂牛奶封闭后，依次第一抗体、第二抗体结合后，ECL发光液中显色。放入GBox-HR凝胶成像分析系统中摄像分析，用Photoshop 7.0软件分析图像，测定各条带积分光密度值。以GAPDH为内参照。

2结果

2.1穿梭质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的鉴定以含重组质粒的菌液为模板行PCR鉴定。连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为338bp，没有连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为304bp，见图1；挑选阳性克隆送测序，测序结果证实shRNA基因序列完全正确已成功插入质粒载体中，见图2。

图1重组质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的PCR鉴定

Figure 1The identification of the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP by PCR

注：1：阴性对照(ddH2O)；2：自连对照(空载体自连对照组)；3：Marker；4：以含pGV120-palm3-shRNA-EGFP质粒菌液为模板

2.2重组腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP的包装及滴定测定骨架质粒pBHGlox_E1, 3Cre和穿梭质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP共转染293细胞10 d后，在显微镜下可观察到细胞病变(典型CPE现象是：细胞排列松散，多数细胞脱落，游离并呈现集拢现象，出现葡萄样病变)，且EGFP充满视野中的绝大多数细胞，表明腺病毒包装成功，见图3；梯度稀释病毒原液，感染接种于96孔板中的293细胞，分析并记录CPE结果，按TCID50法求得重组腺病毒Ad-palm3-shRNA-EGFP感染滴度为3×1010pfu/mL。

2.3Ad-palm3-shRNA-EGFP感染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后PALM3蛋白表达重组腺病毒感染大鼠Ⅱ型AEC 48小时后用Western blot检测PALM3蛋白表达，结果表明Ad-palm3-shRNA-EGFP感染后可显著抑制PALM3蛋白表达(P<0.05)；而与正常大鼠Ⅱ型AEC相比，空腺病毒载体Ad-EGFP感染Ⅱ型AEC后PALM3蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)，见图4。

图2穿梭质粒pGV120-palm3-shRNA-EGFP的测序结果

Figure 2Sequencing results of the shuttle plasmid pGV120-palm3-shRNA-EGFP

图3重组腺病毒包装过程中的细胞病变效应及EGFP表达(×100)

Figure 3The cytopathic effect of 293 cells and the expression of EGFP in the process of packaging of recombinant adenovirus

注:A: 正常生长的293细胞；B: 转染穿梭质粒及骨架质粒10天后出现CPE的293细胞；C: 转染穿梭质粒及骨架质粒后10天后荧光显微镜下观察293细胞形态

3讨论

Paralemmin蛋白家族包括四个成员：paralemmin-1，paralemmin-2，paralemmin-3及palmdephin[5]。PALM3于1992年由Cornish等首次发现报道[1]，相继文献报道，PALM3可能与膜蛋白的运输或靶向有关，可能作为“接头”分子参与信号转导[6]。在前期研究中，我们通过酵母双杂交系统筛选与TIR信号通路负调控分子单免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关蛋白的相互作用蛋白[2, 7]，PALM3为被筛选出来蛋白分子之一，后经进一步免疫共沉淀验证后，确认PALM3为单免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关蛋白的相互作用蛋白。后继研究中，我们以小分子干扰RNA(siRNA)为介导直接转染人肺泡上皮细胞，结果显示下调PALM3的表达可减轻人肺泡上皮细胞对LPS诱导的炎症反应[3]。

图4大鼠Ⅱ型AEC细胞中PALM3蛋白表达的Western blot分析

Figure 4The protein expression of PALM3 in the rat AE2 cells after infection

注：1.正常大鼠Ⅱ型AEC；2.感染Ad-palm3-shRNA-EGFP大鼠Ⅱ型AEC；3.感染Ad-EGFP大鼠Ⅱ型AEC

RNA沉默技术是通过导入细胞19~23 nt的小分子干扰RNA(siRNA)，降解同源mRNA，从而高效、特异性阻断目的基因表达[8]。研究表明，短发夹RNA(shRNA)对于靶基因的干扰作用明显优于siRNA[9]。shRNA的导入需要基因转移载体，目前基因转移载体主要分为病毒载体与非病毒载体，非病毒载体的安全性高，但转染效率低，在活体组织中表达不稳定，限制了非病毒载体在在体基因功能研究中的应用。为进一步在急性肺损伤等炎性失控疾病的动物模型中研究PALM3功能与作用机理，需依赖于构建高效、稳定的基因转移载体。重组腺病毒载体具有宿主范围广，分裂和非分裂细胞均可被转染，病毒基因组不整合宿主染色体，滴定高与容载量大等优点[10]。因此，本研究中选择腺病毒作为载体构建了针对大鼠paralemmin-3基因的shRNA重组腺病毒载体，经过对穿梭质粒的PCR、酶切及测序鉴定正确后，在293细胞中利用AdMax系统进行重组、包装，并在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中验证了其干扰效率，经Western blot检测显示研究所构建的重组腺病毒载体Ad-palm3-shRNA-EGFP具有良好的干扰效果，显著降低了大鼠Ⅱ型AEC中PALM3的表达水平，可以用于后继实验。

4结论

本研究成功构建了靶向大鼠paralemmin-3基因的shRNA重组腺病毒载体，为进一步在细胞水平及活体动物水平研究paralemmin-3基因的功能提供了良好的实验基础。

【参考文献】

[1]Cornish JA, Kloc M, Decker GL,etal. Xlcaax-1 is localized to the basolateral membrane of kidney tubule and other polarized epithelia during xenopus development[J]. Dev Biol, 1992, 150(1): 108-120.

[2]Chen X, Wu X, Zhao Y,etal. A novel binding protein of single immunoglobulin IL-1 receptor-related molecule: Paralemmin-3[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 404 (4): 1029-1033.

[3]陈旭昕, 孟激光, 刘振千, 等. 下调paralemmin-3表达对脂多糖诱导的肺泡上皮细胞核转录因子-κB活性的影响[J]. 广东医学, 2014, 35(19): 2969-2971.

[4]陈蕾, 曾天芳, 周东, 等. 靶向大鼠HIF-1α的RNAi慢病毒载体的构建及鉴定[J]. 西部医学, 2012, 24(6): 1050-1053.

[5]Hu B, Petrasch-Parwez E, Laue MM,etal. Molecular characterization and immunohistochemical localization of palmdelphin, a cytosolic isoform of the paralemmin protein family implicated in membrane dynamics[J]. Eur J Cell Biol, 2005, 84(11): 853-866.

[6]Kutzleb C, Sanders G, Yamamoto R,etal. Paralemmin, a prenyl-palmitoyl-anchored phosphoprotein abundant in neurons and implicated in plasma membrane dynamics and cell process formation[J]. J Cell Biol, 1998, 143(3): 95-813.

[7]Chen X，Zhao Y, Wu X,etal. Enhanced expression of single immunoglobulin IL-1 recepter-related molecule ameliorates Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J]. Shock, 2011, 35(2): 198-204.

[8]Hannon GJ. RNA interference[J]. Nature, 2002, 418(6894): 244-251.

[9]Brummelkamp TR, Bemards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J]. Science, 2002, 296(5567): 550-553.

[10] 陈旭昕, 冯华松, 段蕴铀, 等. 单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白基因腺病毒载体构建及其在体内外表达效力检测[J]. 实用医学, 2013, 29(21): 3489-3492.