炎性因子对人胰腺癌PaTu8988细胞NF-κB及Hedgehog通路成员表达的影响

·论著·

炎性因子对人胰腺癌PaTu8988细胞NF-κB及Hedgehog通路成员表达的影响

王玉琼丁佳寅诸娴吴红玉金晶满晓华高军李兆申

【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子 α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)对人胰腺癌PaTu8988细胞核因子κB(NF-κB)及Hedgehog(HH)通路成员Shh、SMO、Gli1、SuFu基因表达的影响。方法分别应用TNF-α和IL-1β刺激人胰腺癌PaTu8988细胞48 h，以未处理细胞作为对照组。采用实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞NF-κB及Shh、SMO、Gli1、SuFu的mRNA和蛋白表达，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡。结果TNF-α刺激组、IL-1β刺激组、对照组PaTu8988细胞的NF-κB mRNA表达量分别为9.92±0.78、7.74±0.32、1.01±0.08；Gli1 mRNA为7.25±0.45、5.74±0.33、1.00±0.06；Shh mRNA为3.60±0.36、4.33±0.45、1.00±0.04；SMO mRNA为1.03±0.15、1.07±0.16、1.01±0.06；SuFu mRNA为0.88±0.14、0.96±0.13、1.01±0.05。其中TNF-α刺激组、IL-1β刺激组的NF-κB、Gli1、Shh mRNA表达量均较对照组显著增加，差异有统计学意义(P值<0.05或<0.01)。两刺激组的NF-κB、Gli1、Shh蛋白表达量也较对照组增高，差异具有统计学意义(P值均<0.05)。TNF-α刺激组、IL-1β刺激组、对照组PaTu8988细胞凋亡率分别为(17.40±2.87)%、(11.05±1.34)%、(49.90±2.96)%，TNF-α刺激组、IL-1β刺激组的细胞凋亡率均较对照组显著减少，差异有统计学意义(P值均<0.01)。结论TNF-α和IL-1β可激活PaTu8988细胞的NF-κB和HH信号通路的Shh、Gli1基因的表达，减少细胞的凋亡。

【关键词】胰腺肿瘤;Hedgehog蛋白质类；信号传导；炎症;NF-κB

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.01.005

基金项目：国家自然科学基金(81272663，30910103911)；国家科技支撑计划(2006BAI02A12)；上海市重点科技攻关项目(11441901800)

收稿日期：(2014-08-21)

Pro-inflammatory cytokines inhibit apoptosis of pancreatic ductal adenocarcinoma cells via both NF-κB and Hedgehog signaling pathwaysWangYuqiong,Dingjiayin,ZhuXian,WuHongyu,JinJing,ManXiaohua,GaoJun,LiZhaoshen.DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai210043,China

Correspondingauthor:GaoJun,Email:gaojunaaa@gmail.com;LiZhaoshen,Email:zhsli@81890.net

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of TNF-α and IL-1β on the expression of human pancreatic cancer PaTu8988 NF-κB and Hedgehog (HH) signaling pathways members Gli1, Shh, SMO, SuFu. MethodsPancreatic cancer cell line PaTu8988 was treated with TNF-α and IL-1β, respectively, for 48 h, and cells without treatment were control group. Then the protein and mRNA expression of NF-κB and Shh, SMO, Gli1, SuFu was determined by RT-PCR and Western blot; apoptosis of cells were tested by flow cytometry. ResultsThe expressions of NF-κB mRNA in PaTu8988 cells in TNF-α group, IL-1β group, control group were 9.92±0.78, 7.74±0.32, 1.01±0.08; and the expressions of Gli1 mRNA were 7.25±0.45, 5.74±0.33, 1.00±0.06; and the expressions of Shh mRNA were 3.60±0.36, 4.33±0.45, 1.00±0.04; and the expressions of SMO mRNA were 1.03±0.15, 1.07±0.16, 1.01±0.06; and the expressions of SuFu mRNA were 0.88±0.14, 0.96±0.13, 1.01±0.05. The expressions of NF-κB, Gli1,

作者单位：210043第二军医大学长海医院消化内科(王玉琼、诸娴、丁佳寅、吴红玉、金晶、满晓华、高军、李兆申)；解放军411医院分院内科(王玉琼)

通信作者：高军，Email：gaojunaaa@gmail.com;李兆申，Email：zhsli@81890.net

Shh mRNA in TNF-α group, IL-1β group were significantly higher than that in control group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The expressions of corresponding proteins were consistent with the expressions of mRNA. The apoptosis rates in TNF-α group, IL-1β group, control group were (17.40±2.87)%, (11.05±1.34)%, (49.90±2.96)%, and the apoptosis rates in TNF-α group, IL-1β group were significantly lower than that in control group, and the difference between the two groups was statistically significant (P<0.01). ConclusionsTNF-α and IL-1β can activate the expression of NF-κB and Shh, Gli1 in human pancreatic cancer PaTu898, and decrease apoptosis.

【Key words】Pancreatic neoplasms;Hedgehog proteins;Signal transduction;Inflammation;NF-kappa B

流行病学研究发现，高达15%的肿瘤的发生、发展与感染引起的炎症相关[1-2]。转录因子NF-κB是炎症因子中的重要成员，正常情况下与inhibitor kappa B(IκB)结合处于无活性状态，炎症时IκB激酶(IκB kinase, IKK)复合物可被肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)等激活，通过泛素-蛋白酶途径降解，从而释放出NF-κB，从胞质转移到胞核内，进而调控下游基因表达[3-4]。研究证实，NF-κB参与胰腺癌的发生[5-6]。Hedgehog(HH)信号通路在胚胎发育及胰腺癌等肿瘤发生和发展中起重要作用。HH信号通路主要由配体sonic hedgehog(Shh)、跨膜蛋白受体smoothened (SMO)、核转录因子glioma-associated oncogene (Glis)和抑制因子suppressor of fused(SuFu)等组成。一些信号通路也可通过影响SuFu、SMO而活化HH通路[7]。

近期研究发现，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，HH信号通路和NF-κB共同异常增多[7]。为此，本研究应用TNF-α、IL-1β刺激胰腺癌细胞株PaTu8988，检测细胞受刺激后NF-κB及HH信号通路成员表达及细胞凋亡的变化，探讨其作用机制。

材料与方法

一、细胞培养及分组

胰腺癌细胞株PaTu8988由上海长海医院消化内科实验室保存。常规培养、传代。取对数生长期细胞，以5×105个细胞密度接种于10 cm培养皿，共接种3皿，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液(含青霉素、链霉素各10 U/ml)置37℃、5% CO2条件下培养。细胞贴壁后换含1% FBS的DMEM培养液(含青霉素、链霉素各10 U/ml)“饥饿”12 h，分别以10 ng/ml的人重组TNF-α、5 ng/ml的人重组IL-1β刺激PaTu8988细胞48 h，收集细胞。以未处理的细胞作为对照组。人重组TNF-α及IL-1β均购自B&D公司。

二、蛋白质印迹法检测蛋白表达

按蛋白提取试剂盒(Thermo公司)说明书分别提取细胞胞质蛋白及胞核蛋白，以二喹啉甲酸法测蛋白浓度。取待测样本30 μg上样，常规行蛋白质印迹法检测Shh、SMO、Gli1、SuFu、NF-κB蛋白表达，分别以Histone、GAPDH为内参。一抗的工作浓度分别为1∶3 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶200、1∶2 000、1∶2 000，二抗工作浓度1∶5 000，最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。通过凝胶成像系统扫描各条带的灰度值。以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

三、实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测mRNA表达

收集各组PaTu8988细胞，采用Trizol(Takara公司)抽提细胞总RNA。先逆转录成cDNA，再行PCR反应。Shh、SMO、Gli1、NF-κB、SuFu、Histone、GAPDH探针均购自Life Technology公司。实时PCR反应程序：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60℃ 1 min，40个循环。以公式2-△△Ct计算mRNA相对表达量。实验重复3次，取均值。

四、流式细胞仪检测细胞凋亡

Annexin V/FITC 试剂盒购自eBioscience公司，按说明书操作。收集刺激48 h的各组PaTu8988细胞，PBS冲洗3次后以200 μl Binding buffer重悬，加入3 μl Annexin V，暗室放置15 min，加6 μl碘化丙啶，混合后上流式细胞仪(美天妮公司产品)检测细胞凋亡。结果用flowjo软件分析。实验重复3次，取均值。

五、统计学处理

结果

一、TNF-α、IL-1β刺激后PaTu8988细胞Gli1、NF-κB mRNA及蛋白表达变化

TNF-α刺激组、IL-1β刺激组、对照组PaTu8988细胞的NF-κB mRNA表达量分别为9.92±0.78、7.74±0.32、1.01±0.08，蛋白表达量分别为1.00±0.01、0.98±0.03、0.79±0.04，TNF-α、IL-1β刺激组的表达均较对照组显著增加，差异有统计学意义(t值分别为19.19、30.11、14.55、11.44，P值均<0.05，图1)。TNF-α刺激组、IL-1β刺激组、对照组PaTu8988细胞的Gli1 mRNA表达量分别7.25±0.45、5.74±0.33、1.00±0.06，蛋白表达量分别为0.96±0.05、0.93±0.04、0.70±0.04，TNF-α、IL-1β刺激组的表达均显著高于对照组，差异有统计学意义(t值分别为25.11、22.07、5.51、7.22，P值均<0.05，图1)。

图1　对照组(1)、TNF-α刺激组(2)、IL-1β刺激组(3)PaTu8988细胞胞核内Gli1、NF-κB蛋白表达

二、TNF-α、IL-1β刺激后PaTu8988细胞Shh、SMO、SuFu mRNA及蛋白表达变化

TNF-α刺激组、IL-1β刺激组、对照组PaTu8988细胞Shh mRNA的表达量分别为3.60±0.36、4.33±0.45、1.00±0.04，蛋白表达量为0.85±0.05、0.75±0.06、0.60±0.04，两刺激组的表达均较对照组显著增加，差异有统计学意义(t值分别为13.35、13.88、45.08、6.99，P<0.05或<0.01，图2)。TNF-α刺激组、IL-1β刺激组、对照组PaTu8988细胞SMO mRNA的表达量分别为1.03±0.15、1.07±0.16、1.01±0.06，蛋白表达量为0.73±0.04、0.70±0.02、0.72±0.01；SuFu mRNA的表达量分别为0.88±0.14、0.96±0.13、1.01±0.05，蛋白表达量为0.72±0.01、0.74±0.05、0.73±0.00，两刺激组与对照组的差异均无统计学意义(t值分别为0.16、0.57、0.63、2.61、1.52、0.63、0.82、0.32，P值均>0.05，图2)。

三、TNF-α、IL-1β 刺激后PaTu8988细胞凋亡变化

TNF-α刺激组、IL-1β刺激组、对照组PaTu8988细胞凋亡率分别为(17.40±2.87)%、(11.05±1.34)%、(49.90±2.96)%(图3)。TNF-α、IL-1β刺激组的细胞凋亡均较对照组显著减少，差异有统计学意义(t值分别为19.98、29.97，P值均<0.01)。

图2　对照组(1)、TNF-α刺激组(2)、IL-1β刺激组(3)PaTu8988细胞胞质内Shh、SMO、SuFu蛋白的表达

图3对照组(3A)、TNF-α刺激组(3B)、IL-1β刺激组(3C)PaTu8988细胞的凋亡图

讨论

在对弥漫性大B细胞淋巴瘤的研究中发现，NF-κB可激活HH通路，上调SMO的表达[7]。另有研究[8-14]报道，包括EGF/EGFR、Wnt/β-链蛋白、TGF-β1、TGF-β R在内的多个信号通路可影响正常细胞和肿瘤细胞SuFu的作用而调控Glis的表达和(或)稳定性，导致HH通路活化，促进HH靶基因表达。

胰腺癌发病过程极为复杂，有多种信号系统参与。NF-κB和HH信号通路是其中的两个重要系统，它们的相互作用越来越受到学者的关注。Nakashima等[15]研究发现，TNF-α、IL-1β等通过激活NF-кB诱导Shh过度表达，激活HH信号通路，且NF-κB p65与Shh在胰腺癌组织中的表达呈显著正相关，阻断NF-κB可以抑制Shh mRNA的表达。

本研究结果显示，TNF-α、IL-1β刺激胰腺癌PaTu8988细胞后，NF-κB表达上调，同时HH通路的Shh、Gli1基因表达也上调，而SMO及SuFu表达量无变化，提示炎症因子的刺激可同时激活NF-κB与HH通路，两条通路存在一定的相关性，NF-κB可能通过Gli1入核增多而激活HH通路。本研究结果还显示，炎症因子刺激可抑制PaTu8988细胞的凋亡。

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(本文编辑：屠振兴)