奶牛瘤胃液和瘤胃残渣来源固氮菌的比较研究

■张广亮 刘大森，2 吕宗浩 黄国欣 杜江华

（1.东北农业大学动物科技学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.东北农业大学理学院，黑龙江哈尔滨 150030）

固氮菌是指具有生物固氮能力的细菌，根据习性被分为自生固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌。在科学界，对固氮菌的研究以在植物和土壤方面居多(Hurek等,1997;Bellenger等,2014)，但随着生物固氮研究的深入，很多研究者们在动物体内也发现了固氮菌的存在，如Bergersen等（1970）在动物的肠道中分离到了具有固氮能力的细菌。反刍动物瘤胃微生物担负着降解饲料等重要作用，自然对其研究比较多。但是，目前对瘤胃固氮菌分离和作用等研究还很少。Jones等（1974）和纪金春（1993）分别从山羊和绵阳瘤胃液中分离出具有固氮能力的细菌；冀德君等（2006）从山羊的瘤胃液中分离到了兼性厌氧的固氮菌，并做了初步鉴定；李昊等（2013）和仝泳等（2014）分别在奶牛瘤胃液中分离到了兼性厌氧的固氮菌，对菌株进行了初步鉴定，并发现兼性厌氧固氮菌和纤维菌混合添加比只添加纤维菌有益于瘤胃发酵。然而，现有研究都是有关瘤胃液的兼性厌氧固氮菌，缺少瘤胃饲料残渣中此类菌的研究。

本试验将从瘤胃液和瘤胃残渣中分离兼性厌氧固氮菌，通过固氮酶活性，生理生化和分子鉴定指标，对瘤胃液和瘤胃残渣中兼性厌氧固氮菌进行比较研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源

本试验菌株是从3头装有永久性瘤胃瘘管、体况良好的荷斯坦奶牛采集的瘤胃液和瘤胃残渣中分别进行分离。

1.1.2 培养基

无氮固体培养基：每升含0.5 g Na2MoO4、1.36 g KH2PO4、2.13 g Na2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、0.1 g Ca-Cl2、0.2 g NaCl、0.01 g FeCl3、180 g纯化琼脂粉。

LB液体培养基：每升含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，pH值7.2。

1.1.3 主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒（Code No.9763）购买自大连宝生物有限公司；PCR Premix溶液购买自北京金唯智生物有限公司；所用PCR引物由上海生工合成；16S rDNA测序工作由北京金唯智公司完成。

1.1.4 主要仪器

超级洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司，DL-CJ-2ND型）；二氧化碳培养箱（日本三洋公司，MCO-15AC型）；电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，LRH-250F）；气相色谱仪（SHIMADZU,GC-2010型）；基因扩增仪（东胜创新生物有限公司，EDC-810）；电泳仪[EPS 601 POWER SUPPLY型，美国GE（瑞典amersham/pharmacia）]。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离和纯化

在晨饲前采集瘤胃内容物，利用四层纱布将瘤胃液与瘤胃残渣分离，瘤胃液和瘤胃残渣分别在保温容器内保存，迅速返回试验室无菌操作台中操作。称10 g瘤胃残渣溶入90 ml无菌水，为10-1，摇床摇20 min，之后与瘤胃液原液分别用无菌生理盐水倍比稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍后涂布于无氮固体培养基中，39℃厌氧培养48 h后，在10-2和10-3倍稀释情况下培养良好，挑取不同的单个菌落进行单独培养，划线接种于无氮固体培养基上，于39℃在CO2培养箱中培养24～48 h，反复多次，后又在有氧条件下培养几次，直到在显微镜观察下已经纯化。纯化后，观察菌落特征（大小、颜色、形状、边缘、透明度等）并用革兰氏法染色判断阴阳性和用孔雀石绿染色判断有无芽孢。生化鉴定参照《伯杰氏细菌系统鉴定手册》，利用杭州天和生物公司的细菌生化微量鉴定管进行生化鉴定。

1.2.2 固氮酶活性的测定

采用乙炔还原法进行固氮酶活性的测定。将菌株在平板无氮固体培养基上培养48 h后，用接种环挑取10个单个菌落划线于试管中的斜面无氮培养基上。39℃培养72 h后将棉塞换成橡胶塞，注入乙炔气体（最终浓度为10%,V/V），继续培养 72 h，取100 μl反应气体用气相色谱仪测定其乙炔还原量(乙烯生成量)，并折算成固氮酶的活性（周建娇，2013）。不接种空白培养基为阴性对照。

1.2.3 16S rDNA测序

菌株基因组DNA的提取，采用购买的细菌基因组DNA提取试剂盒操作（Code No.9763）。16S rDNA基因序列的PCR扩增，采用通用的简并引物：上游引物27F:5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'，下游引物1492R:5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'。PCR反应在50 μl标准反应体系中进行（Code No.RR902A），PCR扩增条件为：首先，95℃预变性5 min；然后，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次；最后，72℃延伸10 min。扩增产物置于4℃保存。取3 μl PCR产物和适量的Lording buffer混合进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，Marker为DL 2000，将纯化（只有单一条带）的PCR扩增产物送至北京金唯智生物科技有限公司测序。将测序结果在美国国立生物技术信息中心（NCBI）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上用BLAST软件在Gen Bank中进行同源性分析和菌株序列号的申请，与相近典型菌株的基因序列相似度在99%以上可以判定与比较菌种为同一种属，否则为同属下的新亚种。

2 结果与分析

2.1 菌株的生理生化特征

从瘤胃液和瘤胃残渣中分别筛选出6株固氮菌（编号从LY-1到LY-6）和4株固氮菌（编号从LC-1到LC-4），且这10株固氮菌均为兼性厌氧菌。10株固氮菌的革兰氏染色和芽孢染色的结果见表1，就革兰氏染色指标看，从瘤胃液中分离到了2株菌为革兰氏阳性菌，其余都为阴性菌，然而，瘤胃残渣中分离的均为革兰氏阴性菌。从两种来源都各自分离到了1株有芽孢的菌株，分别是LY-1和LC-1。生化鉴定结果见表2，在生化结果中，各菌株有些不同。

表1 菌株的染色鉴定结果

表2 菌株的生化鉴定结果

2.2 固氮酶活性

通过公式计算，菌株的固氮酶活性结果见表3。从表3结果可见，在斜面培养基上培养出的菌体蛋白量基本上一致，从瘤胃液中分离到的6株菌株中，只有LY-1的固氮酶活性较高，其余5株都较低，从瘤胃残渣中分离到的4株菌株的固氮酶活性均较高。

表3 菌株的固氮酶活性

2.3 菌株的16S rDNA鉴定

1.0%琼脂糖凝胶电泳结果见图1，图中显示所有菌株的PCR产物均在1 000～2 000 bp之间出现纯化的单一条带，无其他杂带，且条带明亮，表明得到的基因量很多。

图1 菌株的PCR产物的电泳

测序结果显示：获得的基因片段大小都在1 400 bp左右。以瘤胃液为来源的6株固氮菌中，有3株鲍氏不动杆菌、1株甲基营养型芽孢杆菌、1株索诺拉沙漠芽孢杆菌、1株山羊葡萄球菌。以瘤胃残渣为来源的4株固氮菌中，有2株索诺拉沙漠芽孢杆菌、1株乙酸钙不动杆菌新亚种、1株枝芽孢菌新亚种。根据结果来看，瘤胃液中的LY-5和LY-6为相同种属的菌株，瘤胃液中的LY-3与瘤胃残渣中的LC-2和LC-4为相同种属的菌株。对应菌株最相似的种属关系及相似度和菌株序列号，见表4。

3 讨论

虽然反刍动物瘤胃是一个有复杂的微生物区系的厌氧环境，但在瘤胃中也存在着一定数量的兼性厌氧菌（巩庆亮等，2008；Fan等，2012），瘤胃微生物中的大多数是严格厌氧的，他们遇到氧气会立刻被杀死，然而氧气会随着饲喂饲料、饮水等方式进入瘤胃，进入的氧气会被兼性厌氧菌所消耗，从而使瘤胃内保持为厌氧环境(Kamra，2005)。这些兼性厌氧菌虽然不是瘤胃内数量最多和最主要的细菌，但它们确实在瘤胃内起着一定的重要作用(Kato等，2004)。近些年，虽然有些学者对瘤胃的兼性厌氧菌做了一些研究，但对于瘤胃中兼性厌氧固氮菌的研究还相对较少。在本试验中，从荷斯坦奶牛的瘤胃液中和瘤胃残渣中共分离到了10株具有固氮酶活性的兼性厌氧菌株，并对其进行了16S rDNA基因测序鉴定，进一步证实了瘤胃内兼性厌氧固氮菌的存在。

表4 菌株的种属关系及相似度

测定固氮酶活性时，菌株的菌体蛋白量均在0.001 5～0.002 3 mg之间（见表3），保证了菌株量不对固氮酶活性产生影响。综合分子鉴定的结果来看，从同一来源中分离到的同一种菌属菌株（LY-5和LY-6；LC-2和LC-4）的固氮酶活性基本相同，而从不同来源中分离到的同一种菌属的菌株（LY-3和LC-2、LC-4）的固氮酶活性则有所不同，表明固氮菌的固氮能力是会根据来源环境等条件的不同而变化，菌株的固氮能力相对的（王子芳，1982）。分离到的同一种菌属菌株在瘤胃残渣中的固氮酶活性高于瘤胃液中的，这可能是因为瘤胃残渣来源于外界，进入瘤胃时也会带入一部分空气，这种兼性厌氧菌会附着于残渣中消耗氧气并参与瘤胃发酵，使得酶活提高(Kato等，2004)；或者这种兼性厌氧菌本身就来源于外界，是随着残渣进入瘤胃的，一部分到了瘤胃液中，但其可能更适应有氧条件，在有氧的环境中活动更频繁，活力更高，所以在无氧的瘤胃液中活性比较低。同时从分子鉴定的结果中发现，瘤胃液和瘤胃残渣中都分离到的菌株是索诺拉沙漠芽孢杆菌，其余的菌株都只在一种来源中被分离到，这可能是因为并不是所有的兼性厌氧固氮菌都能生存在多种来源中，有的可能只生存在瘤胃液中，并不附着在残渣上，有的相反；或者可能是分离过程所致，有的菌株可能两种来源都存在，没有都被分离到；又或者可能是有的菌株只在一种来源中酶活很高，数量很多，而在另一来源中则相反，导致只在一种来源被分离到。

从瘤胃液和瘤胃残渣中都分离到了索诺拉沙漠芽孢杆菌。瘤胃中瘤胃液和瘤胃残渣是充分混合存在的，而瘤胃残渣多为日粮饲料或舔舐草料时带入的尘土。所以瘤胃内的这种固氮菌有可能是从外界带来的，这有待进一步研究。根据李昊等（2013）的研究结果，结合本试验发现，兼性厌氧固氮菌和纤维菌混合添加比只有纤维菌的作用效果好，可能是因为添加的固氮菌会附着于饲料颗粒上，其活性高于瘤胃液中的，有利于饲料降解和瘤胃发酵。由于试验中的兼性厌氧固氮菌来源于瘤胃，其宿主适应性和安全性能得到充分的保证，具有微生态制剂或饲用添加剂的开发价值（王炳晓等，2009）。

4 结论

分别从瘤胃液和瘤胃残渣两个来源分离得到6株和4株兼性厌氧固氮菌；在相同来源中同一种属的固氮菌酶活性基本相同，不同来源中同一种属的固氮菌的固氮酶活性差异较大；两个来源中分离到了同一菌属的菌株，即索诺拉沙漠芽孢杆菌，相似度在99%以上。