芬氏纤维微菌对雏鸭盲肠微生物的影响

2016-01-10孙然然朱洛毅孙铝辉齐德生

饲料工业 2016年13期

■赵玲孙然然朱洛毅孙铝辉齐德生

（华中农业大学动物科学技术学院，湖北武汉430070）

黄曲霉毒素被认为是一种致癌性最强且存在最普遍的一种毒素。如何降低黄曲霉毒素的危害一直是很多科研工作者努力的目标。目前国内外去除黄曲霉毒素的方法主要有物理法、化学法以及生物法[1]。其中生物法中的生物降解脱毒法被认为是比较高效安全的一种降解方法[2]。本实验室前期已有报道，从土壤中筛选出的一种黄曲霉毒素降解菌株经鉴定为芬氏纤维微菌（Cellulosimicrobium funkei），属于纤维微菌属。将该菌与AFB1一同灌服给雏鸭时，相比于单独灌服AFB1，改善了肉鸭的生长性能，也改善了肉鸭肝脏的损伤程度。结果表明，该芬氏纤维微菌可以改善受AFB1感染的肉鸭的生长性能以及减缓肝脏的损伤[3]。但是芬氏纤维微菌对于肉鸭盲肠微生物菌群而言属于外来菌种，它是否会对盲肠微生物菌群造成影响尚未有研究报道。本试验就以雏鸭为试验对象，分为5个处理组，每组均饲喂普通日粮，通过经口灌服AFB1、芬氏纤维微菌菌液以及芬氏纤维微菌菌液和AFB1混合物，针对盲肠微生物菌群的变化做相关检测及探究。该试验的探究结果可以为相关产品的开发提供科研依据。

1 材料及方法

1.1 试验材料

伊红-美蓝（EMB）琼脂、MRS培养基、Wilkins-Chalgren琼脂、TPY琼脂（以上均购于青岛高科园海博生物技术有限公司）；芬氏纤维微菌（华中农业大学）；黄曲霉毒素B1(标准品，纯度≥99%，美国Sigma公司)。

1.2 试验动物及日粮

120只1 日龄樱桃肉谷鸭（购于武汉市春江禽业有限责任公司），基础日粮预饲3 d后，选取100只健康、体重相近的雏鸭，随机分为5个组，每组4个重复，每个重复5只雏鸭。日粮均采用商品日粮，且未检出黄曲霉毒素

具体分组如下：

对照组：灌服1 ml无菌LB培养基，连续灌胃14 d

试验组1：C.funkei菌低剂量组，灌服1 ml C.funkei菌液(1×108cfu/ml)，连续灌胃7 d，第8 d开始停止灌服菌液，只灌服1 ml无菌LB培养基，每天灌胃1次。

试验组2：C.funkei菌高剂量组，灌服1 ml C.funkei菌液（1×1010cfu/ml），连续灌胃7 d，第8 d开始停止灌服菌液，只灌服1 ml无菌LB培养基。

试验组3：AFB1处理组，按照0.1 mg/(kg·BW)的量灌服AFB1溶液+1 ml无菌LB培养基，连续灌胃14 d，每天灌胃1次。

试验组4：AFB1+C.funkei菌处理组，按照0.1 mg/(kg·BW)的量灌服AFB1溶液+1 ml无菌LB培养基，连续灌胃14 d。

各组均饲喂肉鸭商品日粮，且日粮中未检出黄曲霉毒素

1.3 饲养管理

饲养试验在武汉市华中农业大学动物科技学院动物营养代谢实验室进行。试验肉鸭采用分栏网上平养方式。试验前一周，将鸭舍、鸭笼彻底清扫和冲洗，封好门窗后用高锰酸钾和福尔马林熏蒸消毒，3 d后将门窗打开通风换气4 d。肉鸭预饲期3 d，试验期14 d（即4～17日龄），整个试验期，每天喂料2次，所有肉鸭自由采食和饮水。每天观察肉鸭精神、摄食、饮水及死亡等情况。

1.4 样品采集和处理

分别于试验期第7 d和第14 d，屠宰鸭子，取出两侧盲肠，用脱脂棉扎口，用于盲肠微生物的测定。

1.5 盲肠微生物指标测定

总需氧菌计数用LB琼脂培养基，总厌氧菌计数用Wilkins-Chalgren琼脂，乳酸菌计数用MRS琼脂，大肠杆菌计数用伊红-美蓝琼脂，双歧杆菌计数用TPY琼脂。C.funkei用LB琼脂培养基。采用平板涂布计数法进行盲肠微生物的计数。无菌条件下取0.5 g盲肠内容物加入5 ml生理盐水进行10倍梯度稀释，然后依次稀释至10-5或10-6稀释度，从适宜的稀释度中吸取100 μl均匀涂布于琼脂平板，然后置于37℃恒温培养箱中培养。其中，乳酸菌、双歧杆菌和总厌氧菌在厌氧条件下培养48 h，大肠杆菌需氧培养24 h，C.funkei细菌和总需氧菌在有氧条件下培养48 h。

1.6 数据处理

各组数据经过Excel 2007初步处理后，利用SAS8.0统计软件进行单因素方差分析，用Duncan's多重比较进行差异显著性分析，当P＜0.05时认为有显著性差异，所有试验数据均以“平均数±标准差”表示（M±SD）。

2 结果

2.1 降解菌株对肉鸭盲肠微生物菌群的影响(见表1、表2)

不同处理对肠道中大肠杆菌的数量均有影响。与对照组相比，试验组1，2均可以显著降低雏鸭盲肠中大肠杆菌的数量（P＜0.05）。而对肠道中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量没有影响（P＞0.05）。试验组2会使总需氧菌和总厌氧菌的数量显著升高（P＜0.05）。

表14 ～10 d雏鸭盲肠内容物微生物含量[log10（cfu/g内容物）]

表211 ～17 d雏鸭盲肠内容物微生物含量[log10（cfu/g内容物）]

在试验第14 d检测雏鸭盲肠内主要微生物的数量变化，与对照组相比，试验组1,2的各盲肠微期生物的数量与对照组均没有差异（P＞0.05）。而且也未检测出芬氏纤维微菌的残留。

2.2 芬氏纤维微菌菌株对AFB1暴露下雏鸭盲肠微生物菌群的影响(见表3、表4)

表34 ～10 d雏鸭盲肠内容物微生物含量[log10（cfu/g内容物）]

表411 ～17 d雏鸭盲肠内容物微生物含量[log10（cfu/g内容物）]

与对照组相比，试验组3使肠道内大肠杆菌的数量显著升高（P＜0.05），使乳酸杆菌的数量显著降低（P＜0.05）。而试验组4各项微生物指标与对照组均无显著差异（P＞0.05）。

与对照组相比，试验组3、4均会使大肠杆菌的数量显著升高（P＜0.05），但是试验组3使大肠杆菌数量增加的幅度更大。试验组3使肠道中总需氧菌显著增加（P＜0.05），使乳酸杆菌的数量显著降低（P＜0.05），对总厌氧菌和双歧杆菌的数量没有显著影响（P＞0.05）。试验组4与对照组相比，各项微生物指标均无显著差异（P＞0.05）。

由以上结果可知，雏鸭灌服AFB1后，可引起盲肠大肠杆菌数量上升、乳酸菌数量降低，造成盲肠微生物区系紊乱。对于AFB1暴露雏鸭，添加芬氏纤维微菌可以降低大肠杆菌和总需氧菌的数量，在一定程度上可以改善盲肠微生物区系。

3 讨论

3.1 芬氏纤维微菌对肉鸭盲肠微生物的影响

动物肠道菌群组成最大决定因素是饲粮，肠道微生物菌群组成受到饲料原料，饲粮脂肪、蛋白质、碳水化合物营养水平，饲粮物理结构（颗粒大小和加工技术），外源饲用酶类以及饲用抗生素（抗生素和抗球虫药）使用的影响[4]。当外源添加微生物在动物饲料中时，应保证外来微生物不会造成动物肠道微生物菌群的紊乱。饲用微生物主要特点之一是可以改善宿主肠道微生态平衡。动物体内的大肠杆菌是机体必不可少的细菌，属于动物肠道的正常菌群，但是大肠杆菌的某些致病菌株会导致动物腹泻及其它多种炎症，造成巨大经济损失[5]。动物体内还有一类可以改善宿主肠道健康的菌群—益生菌。益生菌种类很多，主要包括乳酸菌、肠球菌、双歧杆菌、片球杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、乳球菌、大量的酵母菌及混合培养物等[6]。存在于动物肠道的益生菌主要有乳酸菌和双歧杆菌。乳酸菌和双歧杆菌是维持动物肠道健康的重要菌群，它们可以与其它厌氧菌共同作用占据肠粘膜表面，形成保护性的生物屏障，阻止有害菌的侵入定植[7]。

本试验研究结果表明，对雏鸭连续灌服芬氏纤维微菌一周可以降低盲肠内容物中大肠杆菌的数量，对雏鸭灌服芬氏纤维微菌对乳酸菌和双歧杆菌没有影响。这可能是因为芬氏纤维微菌的胞外代谢产物有抑菌成分，可以抑制大肠杆菌的生长。另外，在动物肠道内存在微生物夺氧机制，当好氧或兼性厌氧菌进入肠道后，在生长繁殖过程中可消耗肠道内的氧气，降低肠道内氧气浓度，抑制其它需氧菌的生长，促进厌氧菌的生长，从而维持肠道微生态区系的平衡[8]。芬氏纤维微菌属于兼性厌氧菌，在生长繁殖过程中可能也存在上述夺氧机制，从而抑制了需氧菌大肠杆菌的生长。在本试验中对雏鸭灌服1010cfu/d的芬氏纤维微菌盲肠总厌氧菌和总需氧菌均显著上升，分析原因可能是因为该菌株属于兼性厌氧菌，在有氧和厌氧条件下均可生长，在测定总需氧菌和总厌氧菌时均含有大量芬氏纤维微菌菌落，从而使这两项指标显著升高。

动物肠道内胆盐、胃内低pH环境以及其它酶类对微生物都有潜在的灭活作用[9]。饲用微生物对其具有一定的耐受性才能在胃肠道生长繁殖从而发挥生理功能[10]。本试验在雏鸭盲肠内容物中检测到芬氏纤维微菌说明该菌株经过胃肠道酸碱环境后可以存活，可以耐受动物胃肠道环境，为以后在动物饲料中的应用提供了依据。同时，对雏鸭停止灌服该菌一周后，在盲肠内没有检测到该菌，说明该菌株是胃肠道的过路菌，无法在肠道定植。

3.2 AFB1对肉鸭盲肠微生物的影响以及芬式纤维微菌对AFB1暴露肉鸭的盲肠微生物区系的改善作用

前期的研究结果表明，给雏鸭灌服AFB1，雏鸭的日增重明显下降，料重比增大，生长性能受到影响，AFB1的毒性作用会严重影响到肉鸭的生产。雏鸭在第一周肝脏出现肿胀，大面积的变性、坏死，毒素摄入一周后，近1/2肝组织被增生的胆管样细胞取代，两周后，接近4/5肝组织被增生的胆管样上皮细胞取代，说明AFB1对雏鸭肝损伤极为严重[3]。

动物的肝功能状态与肠道微生态环境存在紧密的关系。肝脏可以清除来自肠道的酚类、氨类以及内毒素等物质。当肝脏出现功能障碍时，肠道产生的有害物质不能被肝脏代谢分解，有害物质积存在肠道，使肠道环境发生改变，导致肠道菌群失调[11]。Li等[12]研究报道慢性肝病患者会出现肠道微生态失衡的症状，具体表现为以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌增多，而肠道专性厌氧菌显著减少。

肝脏是AFB1作用的靶器官，在本试验中发现，AFB1处理组雏鸭与空白对照组相比，大肠杆菌和总需氧菌数量显著上升，而有益菌乳酸菌显著降低，双歧杆菌也有所降低。结合本实验室之前的研究结果[3]，AFB1导致雏鸭肝脏受损的同时也使肠道微生态环境发生紊乱。对AFB1暴露雏鸭灌服芬氏纤维微菌可以显著降低大肠杆菌和总需氧菌的数量，乳酸菌和双歧杆菌数量也有所上升，说明该菌可使肠道菌群趋于正常。分析其原因，可能是由于该菌可以降解肠道内的AFB1，减少了AFB1的吸收。从而可以减轻其对肝脏的损伤作用[3]。