针刺对血管性痴呆大鼠Bax和Bcl-2表达的影响

针刺对血管性痴呆大鼠Bax和Bcl-2表达的影响

鹿俊磊,顿玲露,卢昌均,曾鉴源,吴玉芬,王少洲,徐榛,赵世亮

(柳州市中医院，柳州 545001)

摘要：目的探讨针刺对血管性痴呆大鼠血清中Bax和Bcl-2表达的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组和针刺组。间断夹闭颈总动脉法建立VaD模型，Morris水迷宫实验检测模型是否成功，酶联免疫吸附法分析(ELISA)检测血清中Bax和Bcl-2的含量。结果针刺治疗后Bax表达较模型组〔(410.176±65.942) pg/mL比(612.353±92.554) pg/mL〕下降(P<0.01),Bcl-2较模型组表达〔(275.509±60.833) pg/mL比(119.246±20.562) pg/mL〕明显升高(P<0.01)。结论针刺可通过上调大鼠Bcl-2水平,下调Bax表达，对抗脑缺血所致的细胞凋亡，防止继发性损伤，达到促进神经修复的作用。

关键词：针刺；血管性痴呆；Bax蛋白；Bcl-2蛋白；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.026

中图分类号：R259文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)08-0841-03

基金项目:国家自然基金地区科学基金(81160472)；广西自然科学基金(2012GXNSFAA053165)；广西中医药大学自然科学研究课题(P2012109、P2012107);柳州市科技创新能力与条件建设项目(2013F010401)。

作者简介:鹿俊磊(1981-)，男，硕士研究生，主治医师，主要从事中西医结合治疗脑血管病的基础与临床研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2014-12-03)

*通信作者:顿玲露，电话-(0772)5357192，电子信箱-lingluhome@aliyun.com

Effect of Needling on Bax/Bcl-2 signaling pathway of rats with vascular dementia

LU Junlei,DUN Linglu,LU Changjun,ZENG Jianyuan,WU Yufen,WANG Shaozhou,XU Zhen,ZHAO Shiliang

(Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Liuzhou 545001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of needling affect to expression of Bax and Bcl-2 of the rats after vascular dementia (VaD).MethodsThe rats were randomly divided into sham operation group,VaD model group and Needling treatment group.The rat model of VaD was built by intermittently clipping common carotid artery.Morris water maze test whether the surgery had been successful and detection the changes of Bax and Bcl-2 by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsBax expression (410.176±65.942) pg/mL compare (612.353±92.554) pg/mL decreased after acupuncture treatment (P<0.01),the Bcl-2 expression (275.509±60.833) pg/mL compares (119.246±20.562) pg/mL increased significantly,Bax/Bcl-2 ratio decreased compared with model group (P<0.01).ConclusionThe acupuncture therapy on vascular dementia maybe related to up-regulated the expression of Bcl-2 protein in rat and decreased Bax protein expression thus regulate anti-apoptotic effect and promotes neurological function recovery in cerebral ischemia injury and prevent secondary injury,to promote the role of nerve repair.

Keywords:needling;vascular dementia;Bax;Bcl-2;rat

血管性痴呆(vascular dementia,VaD)是由一系列脑血管疾病(包括缺血性卒中和出血性卒中)引起的脑功能障碍，表现为患者的认知能力，学习记忆力，判断和计算能力减退,核心症状为获得性智能障碍[1]。随着人口的老龄化，我国血管性痴呆的发病率呈上升趋势，据统计[2]，65岁以上老年人群中，各种类型的痴呆发生率为4.5%，其中血管性痴呆占20%，成为仅次于阿尔兹海默病的第二大痴呆类型。有研究指出，VaD是目前唯一可以通过早期干预手段防治的痴呆类型[3]。但由于其发病机制尚未完全清楚，目前仍缺乏有效的治疗手段[4]。因此，认识VaD的发病机理，探讨预防和治疗其发生发展的有效途径，是当前血管性痴呆研究领域的重要内容。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成员中的一对凋亡调控基因。Bcl-2是抗凋亡基因,可阻止许多因素所诱导的细胞凋亡,而Bax是促凋亡基因，二者的比例是决定细胞是否发生凋亡的重要调控因素。多项研究表明，抑制细胞凋亡是VaD防治的重点[5]。在细胞凋亡的基因调控过程中，Bcl-2家族成员起着至关重要的作用[6]。针灸治疗VaD是当前该领域的研究热点和方向,但是其作用规律和内在机制尚未十分清楚。本研究通过针刺VaD动物模型，探讨其改善VaD学习记忆机制，为针灸治疗VaD提供依据。

1材料和方法

1.1材料实验动物由广西中医药大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(桂)2009-0002]；“华佗牌”不锈钢针，30号0.5寸毫针；Bcl-2酶联免疫(Rat cAMP ELISA KIT)试剂盒(批号：201405)购自上海酶联生物科技有限公司；Bax酶联免疫(Rat PKA ELISA KIT)试剂盒(批号：201406)购自上海酶联生物科技有限公司；酶联免疫检测仪(DG5033A型，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)。

1.2动物模型制备根据Olsson[7]法间歇性夹闭双侧颈总动脉，形成VaD动物模型。应用Morris水迷宫实验确认模型制作效果。

1.3针灸取穴操作参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”，选取百会、大椎、水沟；百会穴向内后方斜刺，大椎直刺水沟穴向鼻根部斜刺；留针30 min，留针其间行针2次，行针手法用平补平泄手法，每次30 s，1次/d，连续4周。

1.4水迷宫测试Morris水迷宫检测分为定向航行实验和空间探索实验2个阶段。通过自动录像系统记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)。空间探索实验：记录大鼠在搜索平台的路线图和对目标区域的穿越次数。

1.5分组及治疗将大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组，每组10只。造模成功后，针刺组开始针刺,1次/d，模型组、假手术组不予针刺治疗，但与针刺组在同一时间、相同程度的捉抓刺激。持续15 d后，收集大鼠的血液，离心分离血清，分装并放置于-80 ℃的冰箱中备用。

1.6测定Bax和Bcl-2含量按照ELISA法试剂盒说明操作，以450 nm波长测吸光度(OD值)，以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值计算出相应的浓度。

2结果

针刺干预治疗后大鼠血清Bax水平与假手术组比较,模型组Bax含量明显升高(P<0.01)。针刺组与模型组比较，Bax含量有显著性差异(P<0.01)；针刺干预治疗后，模型组Bcl-2与假手术组比较，差异无统计学意义。与模型组比较，针刺组Bcl-2含量明显升高(P<0.01)，见表1。

表1治疗后大鼠血清Bax水平和Bcl-2水平

pg/mL

注：与假手术组比较，#P<0.01;与模型组比较，△P<0.01

3讨论

VaD属于中医“呆病”“郁证”“文痴”“健忘”等范畴。目前认为血管性痴呆具有潜在的可防治性，亦被称为“可逆性痴呆”，因此，早期发现和预防具有重要的社会和医学意义。近年来针刺治疗VaD的方法日趋增多,其疗效也得到了初步的肯定。本课题组在临床上长期运用针刺治疗VaD，取得了良好的治疗效果。中医认为督脉为阳脉之海,元神之府，行于脊里，上行入脑。考虑到督脉与脑以及记忆功能的关系密切性，在取穴时多取督脉穴位，其中，百会、大椎、水沟均是益智要穴，也是临床上最为常用的一组穴位，因此，我们选用以上3个穴位作为代表穴位。

研究显示，在脑血管疾病发生后，脑组织中神经元凋亡现象的过度产生能很大程度上加剧脑损伤，引起一系列机体正常生理功能障碍和丧失[8]。Bcl-2蛋白是一种由可以对抗细胞凋亡现象发生的凋亡调控基因[9]合成的蛋白，主要分布在线粒体外膜、内质网和核周膜[10]，Bcl-2可以抑制各种机体病理学损伤所引起的靶细胞凋亡，是具有调节线粒体膜的通透性,维持线粒体膜电位正常状态，抑制CytC和Caspase活性功能的关键蛋白[11]。Bax蛋白作为线粒体膜上离子通道的组成成分,能促进CytC穿过线粒体膜，激活Caspases-9，并进一步激活Caspases-3，发挥促进凋亡的作用，最终导致细胞凋亡现象的发生[12]。研究发现，这两类基因表达的比率决定细胞的生存或凋亡，而抑制Bax通道可以降低缺血再灌注损伤神经元凋亡[13],也表明Bcl-2蛋白家族参与了脑缺血再灌注损伤的发生发展，脑缺血时细胞凋亡主要出现于缺血半暗区，与脑梗塞体积大小有着密切关系[14]，因此针刺能促进微血管的新生和病灶侧支循环的建立，改善缺血性半暗带的脑血流[15]，抑制 Bax的促凋亡作用，降低缺血再灌注区的细胞凋亡，促进细胞的存活。

本研究结果显示:模型组大鼠血清中Bax表达较假手术组明显升高，Bcl-2表达无显著性差异,Bax/Bcl-2比值增高，表明模型成功，凋亡机制被激活。针刺治疗后Bax表达较模型组下降，Bcl-2表达明显升高，Bax/Bcl-2比值降低。表明:针刺一方面可下调VaD大鼠血清中促凋亡基因Bax表达、上调凋亡抑制基因Bcl-2的表达,从而减少细胞凋亡的进一步发生，通过防止继发性损害，达到改善预后的目的。

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