金银花与山银花对致敏大鼠外周血单个核细胞的影响

金银花与山银花对致敏大鼠外周血单个核细胞的影响

李芳1,2，刘冰洁1,2，刘婧慧3，周军1,2，毕宇安1,2，王振中1,2，萧伟1,2*

(1.江苏康缘药业股份有限公司 中药制药过程新技术国家重点实验室,江苏 连云港 222001；

2.江苏省企业院士工作站，江苏 连云港 222001；3.北京中医药大学，北京 100029)

摘要：目的免疫豚鼠获取抗血清，观察金银花与山银花中间体等对豚鼠的致敏性及其对大鼠外周血单个核细胞(PBMC)增殖的影响。方法金银花和山银花各中间体等免疫豚鼠并观察豚鼠致敏情况，收集致敏后豚鼠血清，将其与大鼠PBMC细胞共孵育24 h，建立致敏细胞模型。金银花与山银花各中间体等与致敏细胞共培养24 h，CCK-8法检测大鼠PBMC的增殖情况。结果金银花中间体1、2发生豚鼠过敏反应；山银花中间体1、2发生豚鼠类过敏和过敏反应；金银花与山银花中间体等均抑制体外培养的大鼠PBMC的增殖，但两者相比金银花抑制率偏低。结论参照热毒宁注射液单味模拟药物的制备工艺，金银花对豚鼠的致敏性、对大鼠PBMC的抑制率低于山银花。

关键词：金银花；山银花；外周血单个核细胞

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.01.017

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)01-0057-04

基金项目:科技部重大新药创制项目(2013ZX09402203)。

作者简介:李芳(1980-)，女，硕士，从事药理学及注射剂安全性评价研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-08-15)

*通信作者:萧伟，电话-(0518)85521956，电子信箱-wzhzh-nj@tom.com

Impact of Lonicera japonica and Lonicera confusa on PBMC of sensitized rat

LI Fang1,2,LIU Bingjie1,2,LIU Jinghui3,ZHOU Jun1,2,BI Yu’an1,2,WANG Zhenzhong1,2,XIAO Wei1,2*

(1.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.,Ltd.,State Key Laboratory of New Pharmaceutical Process for

Traditional Chinese Medicine,Lianyungang 222001,Jiangsu Province,China;

2.Enterprises Academician Workstations in Jiangsu Province,Lianyungang 222001,Jiangsu Province,China;

3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract：ObjectiveTo observe the sensitization of the guinea pig and multiplication of the rat PBMC after getting immunized guinea pig antiserum with the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confus.MethodsAfter observing the allergic reaction of the guinea pigs which were sensitized with the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa,the blood serum was collected,then the PBMC of rat was cultured with the blood serum for 24 hours and the cell sensitization model was built.The multiplication of the rat PBMC was detected by CCK-8 technique after the intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa were cultured with the sensitized cell for 24 hours.ResultsThe one and two intermediates of Lonicera japonica were discovered allergy;The one and two intermediates of Lonicera confusa occurred anaphylactoid reaction and allergy in guinea pig;The intermediates of Lonicera japonica and Lonicera confusa both inhibited the proliferation of the rat PBMC.However,the inhibition rate of the intermediates of Lonicera japonica was lower compared with that of Lonicera confusa.ConclusionThe sensitization of Lonicera japonica in guinea pigs and inhibition ratio of rat PBMC were lower than those of Lonicera confuse with reference to the drug preparation technology of single simulation of Reduning Injection.

Keywords:Lonicera japonica;Lonicera confusa;PBMC

近年来，中药注射剂研究取得良好进展，品种增多，疗效更广[1-3]。目前已上市的呼吸系统药物如双黄连注射液、清开灵注射液中，金银花药材出现频率最高。金银花作为常用中药, 《中国药典》1963年版首次收载[4],山银花被2005年版药典首次收载，其植物来源有3种[5]。2005年版药典将金银花与山银花分列后，其检验项目并不能将两种药材完全区分开[6]。目前市场上将山银花作为正品金银花销售的现象也很普遍，不良厂商采用山银花冒充金银花入药以获得高额利润[7-8]。在实际应用中，存在着金银花与山银花药材混用的现象。因此，考察金银花与山银花的安全性显得尤为重要[9]。

1实验材料

1.1动物豚鼠，体质量(300±20)g，雌雄各半，南京安立默科技有限公司提供，合格证号为SCXK(苏)2010-0002。饲养室温度为(23±2)℃，相对湿度在40%～70%，2次/d饲喂蔬菜，自由饮食饮水。Wistar大鼠，扬州大学比较医学中心提供，合格证号为SCXK(苏)2012-0004。饲养室温度为(23±2)℃，相对湿度在40%～70%，自由饮食饮水。

1.2试剂本实验中的药材金银花和山银花均经康缘集团康济大药房主管中药师吴舟鉴定为符合药典规定的金银花与山银花。金银花中间体1(水提液)、金银花中间体2(醇沉液)、金银花中间体3(过膜前中间体)、金银花制剂(注射液),江苏康缘药业股份有限公司提供，批号均为130906,规格为10 mL/支。山银花中间体1(水提液1)、山银花中间体2(醇沉液)、山银花中间体3(过膜前中间体)、山银花制剂(注射液)，江苏康缘药业股份有限公司提供,批号均为140101，规格为10 mL/支。0.9%NaCl注射液，辰欣药业股份有限公司提供，批号为1301158101，规格为100 mL：0.9 g。10%鸡蛋清溶液：将5 mL蛋清以0.9%Nacl注射液10倍稀释，现用现配。DMEM高糖培养基，gibco公司提供，批号为8113384，规格为500 mL/瓶。胎牛血清，gibco公司提供，批号为1122050，规格为500 mL/瓶。淋巴细胞分离液(Ficoll-PaqueTMPREMIUM 1.084)，GE公司提供，批号为10070319，规格为100 mL/瓶。CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，贝博生物提供，批号为BB130041，规格为5000T。

1.3耗材与仪器设备96孔细胞培养板，CORNING公司提供。infinite M200 PRO酶标仪，购自TECAN公司。CO2培养箱，购自Thermo公司。C1028自动细胞计数仪,购自invitrogen公司。CKX41SF倒置显微镜,购自OLYMPUS公司。LD4-2A台式低速离心机，购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。SW-OJ-2FD超净工作台，购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。BXM-30R高压蒸汽灭菌器，购自上海博讯实业有限公司医疗器械。

2实验方法[10-11]

2.1豚鼠致敏将30只雌雄各半的豚鼠称重、标号，随机分组，每组3只，共10组,即阳性对照组(10%蛋清)、阴性对照组(0.9%氯化钠)、金银花中间体1(水提液)组、金银花中间体2(醇沉液)组、金银花中间体3(过膜前中间体)组、金银花制剂(注射液)组、山银花中间体1(水提液1)组、山银花中间体2(醇沉液)组、山银花中间体3(过膜前中间体)组、山银花制剂(注射液)组。给药方式如下：按组别依次腹腔注射10%蛋清、0.9%NaCl、金银花中间体及制剂1.25 g生药/kg和山银花中间体及制剂1.46 g生药/kg，以无菌方式进行操作，每隔1 d腹腔注射上述10种药液，注射体积为0.5 mL/只，注射3次。致敏过程观察豚鼠反应。

2.2抗血清制备末次注射14 d后，豚鼠麻醉后以真空采血肝素抗凝管腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min后，吸取抗血清，按组别分别进行混合。将血清置56 ℃水浴中灭活30 min，0.22 μm过滤后-20 ℃保存备用。

2.3大鼠PBMC细胞分离培养[12-13]大鼠麻醉后，心脏取血4 mL至肝素管抗凝，用0.9%NaCl注射液将血液1∶1稀释，混匀；另取一离心管，先加入4 mL淋巴细胞分离液，再将稀释后的大鼠血液吸4 mL轻轻地叠加在分离液上面，离心机2 000 r/min离心15 min。离心完后将PBMC转移到新试管中，滴加5 mL 0.9%NaCl注射液，轻洗细胞，离心机1 500 r/min离心5 min，洗2次。将细胞数量调整为1×106个/mL接种于96孔培养板,每孔100 μL。设9组，分别为:阴性对照组、金银花中间体1组、金银花中间体2组、金银花中间体3组、金银花制剂组、山银花中间体1组、山银花中间体2组、山银花中间体3组、山银花制剂组，每组5个复孔。

2.4药物对PBMC刺激性检测细胞在培养箱中培养过夜后，弃上清，阴性对照组加入100 μL不含血清的DMEM，治疗组每孔分别加入90 μL不含血清的DMEM和相应组别的10 μL抗血清。37 ℃放置24 h，阴性对照组继续加入100 μL无血清的DMEM，金银花各组分别加入100 μL以无血清的DMEM稀释的浓度分别为3.8 mg/mL的各组中间体与制剂，山银花各组分别加入100 μL以不含血清的DMEM稀释质量浓度为4.4 mg/mL的各组制剂，孵育24 h，每孔加入20 μLCCK-8，作用4 h后，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。按照公式计算细胞抑制率=[1-(药物组OD值/对照组OD值)]×100%。

3实验结果

3.1豚鼠致敏后类过敏及过敏反应观察阳性组、阴性组、金银花中间体3组、金银花制剂组、山银花中间体3组、山银花制剂组致敏时未发现豚鼠类过敏或过敏现象；山银花中间体1组、山银花中间体2组发生类过敏反应,且山银花中间体2组豚鼠因类过敏反应发生死亡；金银花中间体1组、金银花中间体2组、山银花中间体1组、山银花中间体2组致敏时均发生过敏反应。见表1。

表1　致敏豚鼠类过敏及过敏反应症状( n=3)

3.2金银花与山银花各制剂对致敏大鼠PBMC的影响见表2。

组 别A450抑制率/%阴性对照组1.42±0.05—金银花中间体1(水提液)1.17±0.0317.4金银花中间体2(醇沉液)1.13±0.0220.5金银花中间体3(过膜前中间体)1.25±0.0211.7金银花制剂(注射液)1.27±0.0310.9山银花中间体1(水提液)1.12±0.0421.2山银花中间体2(醇沉液)1.10±0.0422.8山银花中间体3(过膜前中间体)1.24±0.0512.5山银花制剂(注射液)1.25±0.0312.2

结果表明，阴性对照组对体外培养PBMC的增殖未见抑制作用，而金银花与山银花各组对体外培养PBMC的增殖有不同程度的抑制作用。金银花中间体3、金银花制剂组抑制率明显低于金银花中间体1、金银花中间体2组;山银花中间体3、山银花制剂组抑制率显著低于山银花中间体1、山银花中间体2组。虽然金银花与山银花各组均对体外培养的大鼠PBMC的增殖有抑制作用，但在相同工艺下金银花制剂的抑制率偏低。

4讨论

急性过敏反应中的主要类型是Ⅰ型变态反应，致敏原刺激机体产生IgE抗体,当机体再次接触相同致敏原时，吸附在肥大细胞等表面的IgE抗体与相应的致敏原结合,引起肥大细胞脱颗粒释放出组胺等过敏介质。然而，许多药物既不是抗原也不是半抗原，这些药物进入人体内，不经过潜伏期，迅速发生与Ⅰ型变态反应相同的临床表现，称之为类过敏反应。类过敏反应引发的肥大细胞脱颗粒无需IgE介导，也无致敏过程,首次接触致敏原即可引发类过敏症状[14-15]。根据制备工艺，本实验中的金银花和山银花在过膜前的制剂极有可能含有大分子物质，因此存在一定的致敏性。本实验通过金银花和山银花共8个中间体及制剂对豚鼠进行致敏试验，观察其对豚鼠的致敏性,并制备相应的抗血清。由于金银花中间体1、金银花中间体2只发生过敏反应,而山银花中间体1、山银花中间体2既有类过敏反应也有过敏反应发生，故而山银花与金银花相比安全性低。外周血单个核细胞包含淋巴细胞和单核细胞,龚超群等[16]在激光共聚焦显微观察实验中发现PBMC细胞多数为T淋巴细胞。有研究[17]表明：在过敏性疾病，如紫癜的发生发展中有细胞免疫功能的减弱,T淋巴细胞数量减少和T淋巴细胞的抑制功能降低等现象。由于CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法，故本实验分离大鼠PBMC细胞后，以CCK-8细胞增殖和毒性检测试剂盒观察其对金银花和山银花中间体与制剂的敏感性。根据结果可知，金银花与山银花各组相应的抗血清及制剂刺激后，金银花和山银花各组中间体与制剂活细胞数量与阴性组相比都减少，表明金银花和山银花有可能通过释放某些抑制性因子进而对PBMC细胞的活化和增殖产生抑制作用。但以相同的生产工艺制备的中间体和制剂，金银花对PBMC细胞的增殖抑制作用比山银花要低。综上所述，从豚鼠的致敏反应观察和对大鼠PBMC的刺激性试验结果来看，参照热毒宁注射液单味模拟药物的制备工艺，金银花的安全性要高于山银花。

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