六神丸对食管癌移植瘤细胞凋亡指数及B淋巴细胞瘤-2基因的影响

六神丸对食管癌移植瘤细胞凋亡指数及B淋巴细胞瘤-2基因的影响

黄立中,张慧，田莎，李俊俊，张远

(湖南中医药大学中西医结合学院，长沙 410208)

摘要：目的探讨六神丸对食管癌移植瘤组织细胞凋亡与B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)表达的影响及相关机制。方法通过皮下注射细胞悬液建立食管癌移植瘤模型,将48只裸鼠随机分为空白组、模型组、顺铂组(DDP)、六神丸高剂量组、六神丸中剂量组、六神丸低剂量组，按照给药方案用药，用药20 d后处死动物，剥取瘤组织，TUNEL(原位末端标记法)检测瘤体组织细胞凋亡指数,免疫组化法检测瘤体组织Bcl-2的表达。结果六神丸高、中、低剂量各组细胞凋亡指数均高于模型组，给药各组瘤体组织内Bcl-2的表达活性均明显下降。结论六神丸通过下调肿瘤组织Bcl-2表达活性、促进细胞凋亡是六神丸抑瘤作用机制之一。

关键词：六神丸；细胞凋亡指数；Bcl-2

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.01.016

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)01-0053-04

基金项目:湖南省研究生创新

作者简介:黄立中(1956-)，男，博士，教授，博士研究生导师，主要从事恶性肿瘤的中西医结合防治研究。

收稿日期:(责任编辑：张瑞彬2014-08-06)

Effect of Liushen Pill on the apoptosis index and expression of

Bcl-2 of esophagus carcinoma xenografts

HUANG Lizhong,ZHANG Hui,TIAN Sha,LI Junjun,ZHANG Yuan

(College of Integradted Chinese and Western medicine,TCM University of Hunan,Changsha 410208,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Liushen Pill on the apoptosis index and the expression of bcl-2 in esophagus carcinoma xenografts.MethodsThe model of esophagus carcinoma xenografts in nude mice was established by hypodermic injection with cell suspension.These mice were randomly divided into 6 groups as follows:blank group,model group,DDP group,high dosage of Liushen Pill group,middle dosage group,low dosage group.The models were treated by dosage regimen.These mice were sacrificed after 20 days treatment and the tumor tissue was peeled.The apoptosis index was examined by TUNEL.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Bcl-2.ResultsThe high,middle,low dosage group can effectively down-regulate the expression of Bcl-2.ConclusionLiushen Pill can inhibit tumor by down-regulating the expression of Bcl-2 and promoting apoptosis.

Keywords:Liushen Pill;apoptosis index (AI);Bcl-2

细胞凋亡是机体细胞的一种主动、程序性死亡，主要是通过内源性核酸内切酶激活而发生的细胞死亡过程。通过体内多种因素参与调节，是机体细胞维持正常新陈代谢的主要形式之一。激活细胞凋亡基因的缺失或细胞凋亡基因的过度表达都将导致细胞无序的增殖，特别是肿瘤细胞。肿瘤的发生不仅与各种癌基因失活有关，而且与肿瘤细胞具有逃过细胞周期监测的能力、调节细胞周期的关键基因改变等密切相关[1]，其中细胞凋亡过程失控能导致肿瘤细胞无限增殖，促进肿瘤的发生、发展。促进肿瘤细胞凋亡能在一定程度上达到抑制肿瘤生长的目的。故细胞凋亡现已逐渐为抗肿瘤作用机制的研究热点之一，且成为开发治疗药物的新靶点。在本课题组前期研究中，结果显示六神丸具有抗食管癌作用，本实验是在前期实验基础上进一步观察六神丸是否能够诱导食管癌细胞的凋亡，从而了解六神丸抗食管癌的作用机制，为六神丸在临床的广泛应用提供依据。

1实验材料

1.1实验动物健康6～8周龄雄性BALB/c裸鼠，体质量为18～22 g，48只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，批号：SCXK(湘)2009-0004。

1.2细胞株人食管癌细胞株(Eca-109)，购于湖南长沙远泰生物技术公司。

1.3主要试剂胰蛋白酶，invitrogen公司。高糖DMEM培养液，invitrogen公司。小牛血清，浙江天杭生物科技有限公司。鼠抗人VEGF单克隆抗体、SABC免疫组化试剂、Bcl-2抗小鼠单克隆抗体、原位细胞凋亡试剂盒TUNEL，购自武汉博士德公司。

1.4实验药物六神丸，10粒/支×6支/盒(每1 000粒重3.125 g)，由雷允上药业有限公司苏州雷允上制药厂生厂，产品批号:IA18005。顺铂(10 mg/支)，由齐鲁制药有限公司出品，产品批号：0070152DB。

1.5主要实验仪器设备SW-CJ-1CV超净工作台，苏净安泰公司。XDS-1B倒置显微镜，重庆光学仪器厂。SHEL-LAB CO2培养箱，Hitachi。TDZ5-40台式离心机，长沙天创仪器公司。普通光学显微镜(CK-Z)。ZDX-35B高压蒸汽消毒器，上海申安器械厂。GG112-10B恒温水浴箱，上海医疗器械厂。101B-2干燥箱，上海亚明公司。双重纯水蒸馏器,上海玻璃仪器一厂。-20 ℃、4 ℃电冰箱，新飞电器公司。GB204分析天平；BFXS-320型离心机，河北白洋离心机厂。SLEE-CUT5062切片机。

2实验方法

2.1动物分组按完全随机的原则查随机数字表将48只裸鼠排8只定为空白组,其余40只按同样的方法于造模后分为5组，即模型组、顺铂组(DDP组)、六神丸高剂量组、六神丸中剂量组、六神丸低剂量组。

2.2动物造模采用皮下注射食管癌细胞悬液方法复制食管癌移植瘤模型。首先用10%水合氯醛0.2 mL腹腔注射，以麻醉裸鼠，然后用75%乙醇消毒进针部位，抽取0.2 mL浓度为1×107/mL的食管癌细胞悬液，注入腋部皮下，随即皮下出现绿豆大皮丘,缓慢退针，稍压针孔，造模完成。待成瘤后病理切片观察到食管癌细胞，证明模型复制成功。

2.3给药方法及分组给药剂量计算方法：根据“人和动物体表体质量折算等效计量”体质量计量公式，dB(g/kg)=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3计算实验动物用药剂量。公式中，dA、dB分别表示裸鼠和人的每千克体质量剂量，RA、RB分别表示裸鼠和人的体型分数(裸鼠为59,人为100)，WA、WB分别表示裸鼠和人的体质量(kg)[2]，临床用药剂量以体质量60 kg成人作为参照。换算实验动物标准用量。

六神丸高、中、低剂量组：各组每只每次分别取浓度为0.266，0.133，0.067 g/mL的六神丸水溶液，根据体质量计算灌胃量，于每日9：00灌胃1次，共用药20 d。顺铂组：现配浓度为0.1 mg/mL顺铂水溶液，每次每只取0.2 mL，于造模后24，48 h各腹腔注射1次，共给药2次。模型组：于每天9：00蒸馏水0.4 mL灌胃1次，共20 d。空白组：常规给予食物、水。

2.4细胞凋亡的检测将石蜡切片放置于60 ℃的烤箱过夜以脱蜡至水,然后在3%过氧化氢中室温孵育5～10 min，蒸溜水冲洗后PBS缓冲液浸泡5 min，放置在构椽酸盐缓冲液中微波中火档加热5 min，再在低火档加热10 min，室温中冷却。取TUNEL试剂盒中1、2号试剂混匀，适量滴加在切片，37 ℃避光保存60 min，于荧光显微镜下观测。加适量3号试剂,保持37 ℃30 min，PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min。继续滴加新鲜配制DAB，显微镜下观察显色时间，不超过3 min，显色后双蒸水冲洗以终止反应，自来水反复充分冲洗。苏木素复染30 min后盐酸酒精分化，自来水回蓝。最后常规脱水、透明，中性树胶封片。

2.5肿瘤组织Bcl-2的表达4%多聚甲醛充分固定移植瘤标本组织48 h，常规进行脱水、透明、浸蜡、包埋，各标本行4 pm连续切片3张，SABC法行Bcl-2免疫组化染色,具体步骤参照试剂盒说明。

3实验结果

3.1肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡的变化TUNEL阳性标记主要位于肿瘤细胞核内,染色后典型的凋亡细胞呈新月形或蚕豆状，呈棕色或棕黄色，特别是在肿瘤坏死的周边部位较明显，如图1示。

结果如表1示，模型组平均细胞面密度(3.51±2.43)，各用药组与模型组相比较细胞凋亡指数均明显增加,DDP组、六神丸高剂量组与模型组比较均有差异且有统计学意义(P<0.01)，六神丸中、低剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果显示：六神丸各用药组均能促进肿瘤组织细胞凋亡，其高剂量作用最为明显，中剂量、低剂量作用差异不明显。

3.2肿瘤组织Bcl-2表达经Bcl-2免疫组化染色后观察，各用药组瘤组织及其间质可见少量棕黄色颗粒，呈片状或团块状分布，模型组阳性表达细胞增多,如图2示。

结果如表2示，模型组平均灰度值为(408.16±63.01),DDP组及六神丸高、中剂量组平均灰度值与模型组比较，均显著降低，差异具有显著统计学意义(P<0.01)；各用药组平均面密度较模型组均显著减少，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。肿瘤细胞中Bcl-2表达在六神丸高、中、低剂量组及DDP组显著减少。

图1　各组肿瘤细胞凋亡的变化

图2　各组肿瘤组织Bcl-2表达

组 别平均面密度模型组3.51±2.43 DDP组12.45±1.98△△六神丸低剂量组6.28±1.71△ 六神丸中剂量组6.40±1.98△ 六神丸高剂量组8.36±2.69△△

注：与模型组比较，△ P<0.05，△△ P<0.01

注：与模型组比较，△△P<0.01

4讨论

六神丸出自《雷允上诵芬堂方》，由牛黄、雄黄、蟾酥、麝香、珍珠、冰片6味药物组成，方中以牛黄、麝香为君药，其中麝香消瘕积聚，能行血分之滞，通经，活血化瘀，散结止痛。佐以珍珠、冰片，其清热解毒、消肿止痛之功更甚，兼以化腐生肌。蟾酥、雄黄为臣药，配合君药，清消兼备，共奏解毒消肿止痛之功。总之，六神丸具有清热解毒，散结消肿，化腐止痛之功效，对痈疽疮疖、无名肿毒、咽喉肿痛等疗效显著。现代药理证明六神丸具有明显的强心、抗炎、镇痛、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、麻醉等作用，临床上对病毒感染性疾病、免疫功能失调性疾病、恶性肿瘤等疾病表现出独特的疗效[3]。近年来在抗肿瘤作用方面，临床上发现其对食管癌、胃癌、白血病等恶性肿瘤具有一定的疗效，同时在其机制的研究上也取得了一定的进展。孙莉[4]研究发现六神丸能明显下调P53基因的表达，启动凋亡机制，阻止肿瘤细胞恶性增殖。李海燕[5]研究发现六神丸可能通过诱导K562/ADM细胞凋亡而抑制细胞增殖，其诱导细胞凋亡的机制可能与抑制Bcl-2表达有关。黄利敏等[6]发现六神丸可能通过降低bFGF和MVD的CD34表达的机制来抑制Lewis肺癌自发肺转移的发生及原发肿瘤、肺转移瘤的生长。李秀荣等[7]发现六神丸可通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，其机理与上调caspase-3和下调survivin的表达有关。有研究[8]发现六神丸对人癌细胞系白血病HL-60、肝癌BEL7402、肺癌A549细胞体外生长均表现出一定的抑制作用,在体内实验[9]中发现六神丸对小鼠S180实体瘤、人移植性肝癌瘤的生长具有明显的抑制作用。齐元富等[10]发现六神丸治疗肺癌的机制可能与其能下调survivin的标的，诱导A549细胞凋亡有关。同时有研究发现六神丸组方中如雄黄[11]、麝香[12]、蟾酥[13-14]均能诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。

Bcl-2是凋亡基因家族中的一个重要成员[15]，是重要的抗凋亡基因，具有抑制凋亡作用。Bcl-2基因在某些血液肿瘤如白血病、恶性实体瘤疾病中均存在高表达，其过度表达可抑制细胞凋亡，从而延长肿瘤细胞的生存，与肿瘤组织的分化程度、临床分期、淋巴结转移等有密切的联系[16]，同时与化疗和放疗失败也有一定的联系。故本实验中，运用TUNEL和免疫组化染色方法检测细胞凋亡指数和Bcl-2,结果显示各用药组细胞凋亡指数明显增加，Bcl-2表达活性下降，这说明六神丸可以通过促进细胞凋亡来抑制食管癌移植瘤的生长，其机制与Bcl-2表达活性下降有关。由于六神丸是传统的复方，其独特的药物组成表示其作用机制也是广泛的，其独特的疗效不仅仅是与某一种机制有关，还需要更深入的研究。

六神丸在临床上广泛应用，但关于治疗肿瘤的研究相对较少，已有的理论、临床研究已为其抑制肿瘤提供了一部分理论支持，随着实验研究的不断深入、细胞生物学及各项分子技术的成熟运用，六神丸抗肿瘤的机制必将会不断被发现，在临床上得到更好的应用，为中医药治疗肿瘤提供新的途径。

参考文献：

[1]EYMIN B,GAZZERI S.Role of cell cycle regulators in lung carinogensis[J].Cell Adhesion & Migration,2010,4(1):114-123.

[2]徐叔云.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2002:87-89.

[3]苗万,刘亚平.六神丸的药理研究[J].中国药物与临床,2011,11(8):935.

[4]孙莉.六神丸抗肿瘤机理的实验研究[D].济南:山东中医药大学,2006.

[5]李海燕.六神丸对K562/ADM细胞增殖的抑制作用及其机制研究[J].辽宁中医杂志,2011,38(6):1216-1217.

[6]黄利敏,刘寨东,齐元富,等.六神丸对Lewis肺癌模型小鼠移植瘤bFGF、CD34表达的影响[J].山东中医杂志,2011,30(10):727-730.

[7]李秀荣,李慧杰,王秀娟.六神丸对肺癌A549细胞Caspase-3及Survivin表达的影响[J].中医学报,2013,28(4):469-471,后插1.

[8]蔡国琴,张聪,郑礼.六神丸对肝癌BEL7402、肺癌A549和白血病HL60的体外抗肿瘤作用[J].中成药,2012,34(5):935-936.

[9]蔡国琴,张聪,郑礼.六神丸体内抗肿瘤药效学研究[J].中成药,2012,34(6):1163-1166.

[10]齐元富,郑,黄利敏,等.六神丸含药血清对人肺癌A549细胞凋亡及凋亡相关表达的影响[J].中医药信息,2014,31(3):67-69.

[11]周思彤,王永胜,易娟,等.纳米雄黄对白血病K562细胞及其干细胞的凋亡诱导作用[J].中药药理与临床,2013,29(2):105-108.

[12]谢仰民,李芳,曹君君.中药麝香胶囊抑瘤作用的实验研究[J].中国比较医学杂志,2008,18(8):29-32.

[13]朱大诚,尹小明,黄学明,等.蟾酥对白血病CEM细胞的抑制作用及诱导其凋亡的研究[J].时珍国医国药,2007,18(10):2398-2400.

[14]高瑞霖,邵义祥.蟾酥提取物对荷瘤小鼠肿瘤细胞形态学实验研究[J].交通医学,2006,20(4):376-378.

[15]SHA GL,WANG L,SUN HL,et al.Protective effects of oxyma trine on myocyt apoptosis in rats with acute myocardial ischemia[J].China pharm J,2007,4(7):501-504.

[16]陈洁,杨红梅,裴瑞,等.食管鳞癌组织中Survivin、Bcl-2蛋白的表达及意义[J].山东医药,2008,48(31):4-6.