阿克醇的来源、测定方法及其与甲烷的关系

■张春华 孙海洲 李胜利 赵存发 张崇志 桑 丹 金 鹿 珊 丹 凌树礼 任晓萍

（内蒙古农牧业科学院动物营养与饲料研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

反刍动物养殖过程中排放的甲烷（CH4），不仅造成饲料能量的损失和饲料资源的浪费，而且对当地环境产生污染，成为重要的温室气体排放源，并严重影响我国畜牧业健康、可持续发展。因此，研究如何降低反刍动物生产中甲烷的排放成为畜牧业可持续发展的关键。目前，测定甲烷排放量的技术主要有：六氟化硫（SF6）示踪法、呼吸代谢装置测定技术、体外产气法、CO2示踪技术、模型化方法、微气象测定技术、生物指示物法等，还有很多种方法正在发展过程中。其中，SF6技术由于具有较高的可变性而不适合用于比较个体动物的甲烷排放量[1]。呼吸代谢装置测定技术费时、费力且不能应用于放牧动物甲烷排放量的测定。其他方法或者需要大型仪器设备、或者试验周期较长、或者容易受环境条件的影响，都存在着一些不足。因此，开发简便快捷的测定反刍动物甲烷排放量的技术，对于准确测定反刍动物内源甲烷排放量、筛选有效的减排技术措施具有重要意义。目前，国外介绍了一种测定甲烷排放量的方法，主要通过测定反刍动物粪中产甲烷菌膜脂物质阿克醇（archaeol）含量来预测甲烷排放量。已有的研究表明，粪中阿克醇含量与甲烷产量之间的相关性不是很强，差异显著（r=0.55，P＜0.05）[2]；但Mc-Cartney等[3]的研究结果得出粪中阿克醇含量与甲烷产量之间存在着显著的正相关。那么粪中阿克醇含量与甲烷产量之间到底存在着什么样的相关关系，目前有关这方面的研究比较少。本文主要综述了阿克醇的结构、产生过程、测定方法以及与甲烷产量之间的关系，为最终建立通过测定粪中阿克醇含量来预测反刍动物内源甲烷产量的方法提供理论依据和技术参考。

1 阿克醇的结构

阿克醇为产甲烷古细菌膜脂，化学名称为1,2-双植烷酸甘油（2,3-diphytanyl-O-sn-glycerol），其分子结构由聚异戊二烯链与极性头部通过醚键连接而构成，它的分子结构式详见图1。

图1 阿克醇分子结构[4]

2 阿克醇的产生过程

2.1 产甲烷菌的脂质结构

人或动物胃肠道中可以产生甲烷的微生物称作产甲烷菌，产甲烷菌都属于原核生物中的古细菌。产甲烷菌产生的甲烷是瘤胃发酵能损失的主要原因，可导致反刍动物高达6%～15%的总能量以甲烷排放的形式损失掉。古细菌的极性脂质有别于真细菌和真核生物的正常脂质，是以植烷醇结构为特征。真细菌和真核生物的极性脂质主要是由两条直链脂肪酸通过酯键（-CO-O-）与甘油分子结合而形成软脂酸盐（palmitate）。在古细菌种系未发现之前，这种脂质是所有生物所共有的特征，这种脂质通常称为正常脂质。其后的研究发现，极端嗜盐细菌和嗜热嗜酸菌的极性脂质与正常脂质不同，虽然它们的脂质也是由甘油和两条长链烃类结合而成，但甘油和长链烃之间的结合是通过醚键（-O-）而不是酯键，并且这种烃链不是直链，而是支链，其链中每隔4个碳原子就有一个甲基（-CH3）。这种支链甘油醚的极性脂质结构是古细菌的最基本特征，这一结构称为植烷醇（phytanol），即古细菌脂质（archae bacterial lipid）。真细菌和真核生物膜脂质通常是由一个磷酸盐头连接到甘油主链的sn-1,2位置酯化成酰基，而古细菌膜脂质是由磷或磷糖头连接到甘油主链的sn-2,3位置形成二烷基甘油醚（DAGE）脂质。

研究发现，产甲烷菌的膜脂质与极端嗜盐菌和嗜热嗜酸菌的膜脂质一致，主要是由甘油二醚、四醚、大环醚和羟基醚（sn-3和sn-2羟基醚）所构成[5]，所有古细菌的膜脂质均含有共同的甘油醚脂类结构，这也成为了在种系发生上古细菌不同于真细菌和真核生物的重要标志之一。产甲烷细菌膜脂质结构的基本骨架主要为：阿克醇、卡克醇（caldarchaeol）、马克醇（macrocyclic archaeol）和海克醇（hydroxyarchaeol），其中，植烷醇甘油二醚为阿克醇，二植烷醇二甘油四醚为卡克醇，大环醚为马克醇，羟基醚为海克醇，分为sn-3海克醇和sn-2海克醇，具体基本结构详见图2。阿克醇（2,3-diphytanyl-O-sn-glycerol）是最简单的甘油醚，广泛分布在古细菌中。

图2 产甲烷细菌的五种基本脂质结构[5]

2.2 阿克醇的来源

研究证实，阿克醇主要是日粮在通过反刍动物消化道内经过消化，在粪中可检测到，在其他草食动物的粪中则没有发现阿克醇[6]，在动物日粮中也没有被检测到。为此，Mould等[7]对其进行了研究，发现阿克醇最可能是由瘤胃中的原核生物所产生，且数量要高于后肠道或粪中，Lin等[8]采用16s RNA法发现瘤胃中由产甲烷菌产生的阿克醇的浓度要高于动物后肠道所产生的阿克醇的浓度，进一步证实了阿克醇主要是在反刍动物的瘤胃中由产甲烷菌产生，通过消化道随粪样排出。

3 阿克醇的测定方法

阿克醇含量的定量测定主要采用气相色谱质谱法（GC-MS）。首先采集反刍动物新鲜粪样，于65℃烘箱中烘干72 h，研磨过0.8 mm筛制成风干样以备分析；其次，采用改进的单相提取方法[9]取粪样中的总脂肪含量，通过酸性甲酯化反应去除总脂肪的极性头部基团，采用柱层析法得到醇部分；最后，对醇部分进行三甲基硅基化衍生化后（溶剂为乙酸乙酯），就可以采用气相色谱质谱仪对其进行分析，通过对比内标1,2-双二十六烷基甘油（1,2-di-O-hexadecyl-racglycerol）就可对阿克醇进行定量分析。

4 阿克醇含量与甲烷产量的关系

日粮结构显著影响着动物所产生的甲烷产量[1，10]。动物采食高粗料饲粮，其甲烷产量显著高于采食高精料日粮。Johnson等[11]分析了奶牛日粮精粗比与甲烷产量之间的关系，发现采食高精料日粮后奶牛排放的甲烷量明显少于采食高粗料日粮，原因主要为：精料在通过瘤胃时具有较高的流通速率、丙酸产量增加[11]、瘤胃中较低的pH值环境可直接抑制产甲烷菌的产生量[12]等。阿克醇是日粮在通过动物胃肠道中产生的，属于产甲烷菌膜脂质的基本结构，通过测定粪样就可测定出阿克醇的含量[6]。研究表明，虽然动物日粮搭配方式显著影响甲烷的产生，但粪中阿克醇含量与甲烷产量之间的相关性不是很强（r=0.55，P＜0.05），原因可能是该实验中所使用的SF6技术存在实验误差，或者瘤胃中产甲烷菌并非都来源于古细菌等因素造成的[2]。另有研究表明，甲烷产量与瘤胃中产甲烷菌数量之间的相关性不是很强，原因可能是对瘤胃中古细菌种群的估计可能存在较大的实验误差而造成的[13]。但最新一项研究表明，粪中阿克醇含量与甲烷产量之间存在着显著的正相关关系[3]。

对于非反刍草食动物，诸如马、斑马、象、犀牛来说，其胃肠道中的产甲烷菌也产生阿克醇，但由于所产生的阿克醇含量低于采用该种方法进行检测的检测限，所以采用这种方法在粪中检测不到阿克醇的含量。目前发现，影响阿克醇含量、瘤胃中产甲烷菌数量和甲烷产量之间关系的其它因素还包括瘤胃中古细菌的可选择性保留，造成每个细胞中阿克醇含量产生差异的产甲烷菌群物种组成差异，DAGE过瘤胃消化差异、非产甲烷古细菌产生阿克醇的含量等。目前，国外有关反刍动物和非反刍动物粪中阿克醇含量与甲烷产量关系的文献报道的比较少，国内则没有这方面的研究报道。因此，有关粪中阿克醇含量、瘤胃中产甲烷菌数量和甲烷产量三者之间的关系还需做更深入的研究。

5 小结

目前，测定动物机体甲烷排放量的方法虽然很多，但每种方法都有其局限性。阿克醇是瘤胃中产甲烷菌膜脂质的基本结构，通过测定动物粪中阿克醇的含量就可预测出甲烷产量。虽然不同的学者对反刍动物粪中阿克醇含量与甲烷产量之间的相关关系得出的结果不一致，但都表明二者之间存在着一定的相关性。目前，该方法是否能在我国反刍动物生产实践中进行推广应用，还需通过对我国的反刍动物的粪中阿克醇含量、瘤胃中产甲烷菌数量和甲烷产量之间的相关关系做进一步验证。