植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶基因的乳酸克鲁维酵母工程菌的构建

■李晨曦 赵国芬

（内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010010）

共轭亚油酸（conjugated linoleic acids,CLA）是指一组含有共轭双键的亚油酸几何位置异构体。共轭亚油酸具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、消除炎症和抗肥胖等有益的功效[1]。但其在天然食品中的含量较低，如何获得安全高效的生产方法显得尤为重要。亚油酸异构酶（linoleate isomerase,LA）是一种能够催化亚油酸生成共轭亚油酸的酶，获得高活性的亚油酸异构酶是生产高活力、高纯度共轭亚油酸的瓶颈。许多微生物体内有亚油酸异构酶，但这些微生物大多是厌氧菌，直接用这些微生物发酵生产CLA，条件难以控制；LAI为胞内酶，产量低，且结合在细胞膜上，分离纯化困难，制约了酶法生产CLA。所以，利用基因工程手段构建高效表达亚油酸异构酶基因的工程菌株[2]来获得LAI显得尤为重要。前人构建的重组工程菌株中，以重组植物乳杆菌亚油酸异构酶基因占多数，且大多数为原核表达系统[3]，表达的酶活也不十分理想。而酵母是低等真核生物，除具有大肠杆菌的生长快、易培养、遗传操作简单优点外，还具有真核生物对蛋白质的正确加工、修饰、以及空间折叠等功能，克服大肠杆菌表达系统的不足。因此通过实验构建酵母表达载体[4-6]，为进一步转化酵母工程菌实现体外表达提供了必要条件，并为将构建高产CLA基因工程菌株大规模应用在饲工业生产中奠定基础[5]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和克隆载体质粒

植物乳杆菌P-8(本实验室保存）、大肠杆菌DH5ɑ感受态（鸿之惠商贸有限公司）、酵母穿梭质粒pKLAC1（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.1.2 培养基

LB(Luria-Bertani)培养基：用于培养大肠杆菌，胰蛋白胨1%,酵母提取粉0.5%,NaCl 1%,121℃高压蒸汽灭菌20 min。灭菌后可室温保存（如配制固体培养基加入2%琼脂粉于LB培养基中）。

MRS（Man Rogosa Sharp broth）培养基：用于培养植物乳杆菌P-8,酪蛋白胨1%,牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，醋酸钠0.5%,柠檬酸二铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，吐温-80 0.1%，七水硫酸镁0.02%，十二水合硫酸锰0.005%，pH值6.8，121℃高压蒸汽灭菌20 min（如配制固体培养基加入2%琼脂粉于MRS培养基中)。

1.1.3 酶和试剂

限制性内切酶NotⅠ、XhoⅠ、蛋白酶K(购自于Takara）、Taq DNA聚合酶、T 4连接酶(购自于北京全式金生物技术有限公司）、高纯质粒小量制备试剂盒、薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（均购自于上海捷瑞生物工程有限公司）。

TE缓冲液、1 M Tris-HCl(pH值6.8)、20 mg/ml溶菌酶、10%SDS、5 M NaCl、0.7 M CTAB/NaCl、酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1)、氯仿/异戊醇（24∶1）、异丙醇（预冷）、70%乙醇（预冷）。

1.1.4 引物

植物乳杆菌P-8 LAI基因序列利用Primer 5.0软件，针对酵母载体pKLAC1的多克隆位点，设计了一对PCR扩增引物（由上海捷瑞生物有限公司合成）：

上游引物P1：

5′-cgCTCGAGATGGTTAAAAGTAAAGCAATAT TGA-3′（下划线为XholⅠ酶切位点）；

下游引物P2：

5′-cgGCGGCCGCTTAATCAAACATCTTCTTAGTT GC-3′（下划线为NotⅠ酶切位点）。

1.2 试验方法

1.2.1 植物乳杆菌P-8总DNA的提取

采用CATB法提取。

1.2.2 植物乳杆菌LAI基因的PCR扩增

以植物乳杆菌P-8的DNA为模板，进行PCR。PCR反应条件：94℃预变性5 min，循环条件为：94℃变性30 s，54℃退火1 min，72℃延伸2 min；循环30轮后，72℃保温10 min并终止反应。产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将目的条带切胶回收试剂盒纯化。

1.2.3 LAI基因PCR产物的克隆及鉴定

凝胶回收的LAI基因连接到pMD19-T载体上，热冲击法转化氯化钙法制备的感受态E.coli DH5 α，对阳性克隆用菌落PCR、XholⅠ与NotⅠ双酶切和序列分析进行鉴定。

1.2.4 LAI酵母表达载体的构建

pKLAC1质粒和重组质粒pMD19T-LAI进行XholⅠ、NotⅠ双酶切，将从pMD19T-LAI切下的LAI基因连接到酶切后的表达载体pKLAC1上。

1.2.5 乳酸克鲁维酵母感受态的制备及转化

采用电击法制备酵母感受态细胞；采用电转化法转化重组质粒。

1.2.6 阳性转化子的筛选和鉴定[7]

采用菌落PCR的方法和序列分析鉴定阳性转化子。

2 结果

2.1 亚油酸异构酶基因的PCR扩增

以Lactobacillus.P.P-8的基因组DNA为模板通过PCR扩增LAI，经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到1 700 bp的片段（见图1），与预期大小相同。

图1 PCR扩增结果电泳图

2.2 鉴定重组质粒pKLAC1-LAI

经过菌落PCR用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，有目的条带的菌液在含100 μg/ml Amp的LB液体培养基中过夜培养。对培养到呈浑浊的菌液进行重组质粒的提取，提取后的质粒再通过XhoⅠ与NotⅠ双酶切反应，进行0.7%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到1 700 bp片段（见图2、图3），成功构建重组表达载体。

图2 菌落PCR鉴定

图3 双酶切鉴定

2.3 测序鉴定

挑取白色阳性克隆菌株，经PCR鉴定含有目的片段的单菌落与液体YPD培养基中振荡培养过夜，菌液送上海捷瑞生物有限公司测序，测序结果如上，经DNAMAN软件进行序列比对，与保守序列相似度达99.9%。

3 讨论

共轭亚油酸具有很多功能，其中研究较为突出的有：抗癌、抗动脉粥样化、延缓机体免疫力衰退、减肥等功能。本试验构建了植物乳杆菌P-8来源的亚油酸异构酶基因乳酸克鲁维酵母工程菌株[8-9]，这是国内首次从Lactobacillus.P.P-8克隆出亚油酸异构酶基因并在乳酸克鲁维酵母中得到分泌表达，不仅简化目的蛋白分离纯化过程[10-11]，还能有效防止被胞内蛋白降解，为大规模应用到饲料工业中提供必要条件[12]；为进一步将该基因引入可食微生物菌体产生CLA，开发保健功能性食品提供了试验基础。