花魔芋离体再生体系的建立

秦廷豪 李晓梅 张军 黄运军

摘要：以花魔芋（Amorphophallus konjac）为材料比较不同灭菌方式对不同外植体的灭菌效果及生长的影响，不同激素浓度及组合对魔芋愈伤组织、不定芽诱导的影响，探讨了固液2种培养方式对继代培养的影响。结果表明：球茎和根状茎均可作为较为理想的外植体;魔芋愈伤组织诱导最适激素组合为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，最适不定芽诱导培养基为MS+2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA或MS+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA;液体培养更适合魔芋愈伤的继代增殖，其不定芽平均增殖率可达4.69。

关键词：花魔芋（Amorphophallus konjac）;再生体系;愈伤组织;不定芽

中图分类号：S632.3        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-6054-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.066

Establishment of Regeneration System in vitro Culture of Amorphophphallus Konjac

QIN Ting-hao1，LI Xiao-mei2，ZHANG Jun1，HUANG Yun-jun1

（1.Sichuan Province Plant Engineering Research Institute， Zizhong 641200，Sichuan，China;

2.Sichuan Provincial Academy of Agricultural Sciences Institute of Rice and Sorghum，Deyang 618000，Sichuan，China）

Abstract：Taking Amorphophphallus konjac as material， the effects of different sterilizing methods on the regeneration capacity of different explants were compared， the influences of different hormone levels on callus and adventitious buds induction were studied， and the effects of solid culture and liquid culture on subculture were also discussed. The results showed that corm and rhizome are the optimum explants for callus induction. The optimum hormone combination for konjac callus induction is MS 1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA， and the optimum media for adventitious buds induction is MS+2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA or MS+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA， and liquid culture would be suitable for subculture of konjac callus， the reproduction rate of adventitious buds can be up to 4.69.

Key words： Amorphophallus konjac; regeneration system; callus; adventitious bud

魔芋（Amorphophphallus sp）是中国传统栽培的重要作物，在四川、云南、贵州、湖北、广西和台湾等地有广泛分布[1]。据统计，中国现有魔芋属植物21种，可食用的有9种，其中大面积主栽培种为花魔芋（A.knojac）和白魔芋（A.albus）[2]。魔芋是迄今发现的植物界中惟一能大量合成葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）的高等植物。葡甘聚糖是魔芋地下球茎主要贮藏物质，为一种高分子碳水化合物，具有良好的胶溶性、凝胶性、增稠性、成膜性及与其他植物胶的复配性等优点，因而在食品、化工和医药等领域具有广泛的用途[3]。

通常利用根状茎或小球茎对魔芋进行无性繁殖，其种芋生产存在繁殖系数极低，生长周期长，农艺性状一致性差，变异、退化及病害积累严重等问题。根状茎和小球茎当年不能形成商品芋，用于商品芋的魔芋种芋数量有限，不能满足生产的需要，制约了魔芋种植及相关产业的发展[4]。开展魔芋组织培养技术的研究，形成一套适合魔芋自身特点的离体繁殖体系，是建立魔芋良种繁育体系的前期工作，也是解决目前魔芋生产中种芋问题的关键。有关魔芋的组织培养已经取得较多研究成果[5，6]，但仍存在前期培养污染率高，不同魔芋品种在分化能力、分化周期、繁殖系数及试管苗存活率等方面相差较大等问题。本试验以四川省资中地区花魔芋农家品种为材料，比较不同灭菌方式对不同外植体的灭菌效果及生长的影响，不同激素浓度及组合对魔芋愈伤组织、不定芽诱导的影响，探讨了固液2种培养方式对继代培养的影响，旨在建立该材料最佳的离体再生体系，为魔芋良种的生产提供指导。

1  材料与方法

1.1  材料

供试球茎、根状茎、幼叶柄取自资中县花魔芋农家品种，种植于四川省植物工程研究院试验地。

1.2  方法

1.2.1  灭菌方法与外植体的筛选  将田间釆回的魔芋球茎、根状茎及长约10 cm由鳞片包裹的叶组织洗净，放入800倍多菌灵稀释液中浸泡5 min，于流水下冲洗30 min后，球茎、根状茎刮去表皮晾干待用，叶柄去3层鳞片，于超净工作台上灭菌，75%乙醇灭菌1 min，采用0.1%、0.2%HgCl2溶液分别灭菌10、15 min，用无菌蒸馏水清洗4次，每次5 min。将灭菌后的球茎、根状茎切成大小约1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的块状，叶柄切成约0.5 cm厚的圆饼，转入MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.5 g/L琼脂+0.5g/L活性炭（pH=5.8）的培养基中，每处理接种30个外植体，30 d后统计污染数、褐变坏死数及诱导率。

1.2.2  愈伤组织的诱导  将筛选的最佳外植体接种于添加不同激素的愈伤组织诱导培养基中，其基本培养基为MS培养基，并添加3%蔗糖、0.55%的琼脂与0.5 g/L的活性炭，pH=5.8。外植体于25 ℃黑暗中培养30 d 后，转入1 500 lx光照条件下培养，每4周转接一次，60 d后统计愈伤组织诱导情况。

1.2.3  愈伤组织的分化培养  将诱导出的良好愈伤组织转入不同的分化培养基中，其基本培养基为MS培养基，并附加3%蔗糖、0.55%的琼脂与0.2 g/L活性炭，pH=5.8。愈伤组织于25 ℃、2 000 lx光照条件下培养，每4周转接一次，转接时轻轻刮去表皮黑色物质，45 d后统计分化情况及成苗数。

1.2.4  继代培养  预试验中发现，愈伤组织分化出的幼苗会抑制周围不定芽的分化，因此需将分化芽与愈伤组织分开进行继代培养，将2种培养材料分别继代于固、液培养基中（MS+2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+5.5 g/L琼脂+0.2 g/L活性炭）培养，45 d后观察不同培养方式对其继代增殖的影响。

1.2.5  生根培养及炼苗移栽  将长至4 cm左右，叶片露出鳞片的幼苗切下，移入不同浓度6-BA与NAA组成的1/2MS生根培养基中，当幼苗叶片充分展开，健壮根数达3条以上时，将培养瓶移出培养室，室外遮阴炼苗7 d以上，移栽前打开瓶盖炼苗2 d，于自来水下清洗干净幼苗上残留的培养基，置入500倍农用链霉素+800倍多菌灵的混合液中浸泡10 min，移栽至园土∶蛭石=1∶1（体积比）的盆钵内，放于阴蔽处，每天喷施自来水保持湿度，7 d后移入适度遮阴条件下培养。

2  结果与分析

2.1  魔芋不同外植体经不同灭菌处理后的诱导效果

外植体在接种3 d开始有不同程度的污染出现，未受污染的外植体7 d开始褐变或者膨大。由表1可知，不同灭菌处理对魔芋外植体的生长有不同影响。外植体的污染数随着灭菌强度的增加而减少，坏死数随着灭菌强度的增加而增加。根状茎的坏死数量明显高于球茎的坏死数，其原因在于球茎灭菌前体积较大，根状茎体积较小、组织更加幼嫩，较高的灭菌强度对外植体有一定的杀伤作用，导致根状茎坏死数较多，影响其诱导率。本试验中叶柄因灭菌强度大造成外植体坏死数量较多，但能看出叶柄作为外植体的脱分化能力较低，大多数外植体未进行脱分化即褐化、死亡。球茎和根状茎都可以作为较为理想的外植体，采用75%乙醇1 min+0.1%～0.2%HgCl2 15 min处理比较适合魔芋球茎和根状茎的灭菌，其愈伤诱导率分别达63.3%、56.7%。

2.2  不同培养基对魔芋愈伤组织诱导的影响

将魔芋球茎外植体接种于添加不同浓度生长调节剂组合的愈伤诱导培养基中，7 d左右开始膨大，并逐步在外植体表面形成瘤状突起，起初的瘤状突起小而密，呈浅绿色，后慢慢变大，一些突起变成粉红色、浅白色或暗绿色（图1），其质地紧密，较难切割，少部分愈伤组织慢慢褐化，质地软，切后水分多，仅中心为白色，周围全部变黑，失去增殖能力，这与胡建斌等[7]观察的魔芋愈伤组织形态结果一致。各组合对魔芋球茎愈伤组织诱导的效果见表2。

由表2可知，魔芋球茎外植体在不同浓度生长调节剂组合下其愈伤诱导率差异明显，其最优组合为1.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L NAA，其次为2.0 mg/L 6-BA +2.0 mg/L NAA，愈伤诱导率分别为68.42%、65.38%，可见当细胞分裂激素与生长素比值接近时更利于魔芋愈伤组织的形成。

2.3  不同培养基对魔芋愈伤组织分化的影响

魔芋愈伤组织在转入分化培养基约30 d左右开始分化，其分化途径有两种：①瘤状突起上长出淡绿色或粉色带鳞片的芽点，但有部分芽为无效芽，仅有鳞片分化，鳞片中间无有效生长点（图2a）。②瘤状突起分化出底部圆球状的拟球茎，其上有一个淡粉色或白色较大芽，随着培养时间的延长，拟球茎上会分化出侧芽（图2b），这与前人观察到的分化途径相似[8]。分化的有效芽鳞片慢慢伸长，变成粉色或绿色，待鳞片长至3 cm左右后，可见绿色叶片长出。

愈伤组织的分化途径虽然相似，但其在不同浓度激素组合下，其分化能力各有不同。由表3可知，在生长素不变的情况下不定芽的分化率及出芽数大多随着6-BA浓度的提高而增加，其适宜培养基为2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。TDZ为高效细胞分裂素，在相对较低浓度下具有较好的分化效果，最佳浓度为0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA，虽然TDZ对不定芽的诱导效率稍好于6-BA，但其价格较高，为了节约成本在生产上选择6-BA。

2.4  不同培养方式的魔芋继代效果

将愈伤组织上分化的较大芽切下，分别转入基本培养基MS附加2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA的固体和液体培养基中进行继代培养，结果发现在顶端优势解除后，不定芽能较快进行伸长生长，并且愈伤组织迅速膨大，可在较短时间内完成进一步的分化;继代培养一个周期（45 d）统计表明，固体继代培养与液体继代培养的芽增殖倍数分别为2.53、4.69，相比固体培养基而言，液体培养基中愈伤组织褐变减轻，分化的不定芽更健壮，长成的苗叶柄更粗，叶片更厚实，叶色更绿（图3），因此其最适宜魔芋愈伤组织及分化继代培养。

2.5  生根及炼苗移栽情况

在增殖培养过程中，分化出的不定芽在生长的同时，有大约一半芽的基部有1～3条根形成，在不同浓度生长素的魔芋组培苗生根情况见表4。由表4可知，在同等浓度6-BA作用下，提高生长素NAA的浓度有利于魔芋根的形成，在NAA配合IBA的适当浓度下，促进根的形成和早发快生，能够提早生根2～4 d，缩短生根时间，并形成更健壮和较多的根。待魔芋幼苗长至10 cm左右时，根数达3条以上后（图4），将试管苗移出至室外弱光炼苗7 d以上，移栽前洗净根部培养基，进行根部灭菌处理后移栽入蛭石∶园土（1∶1，体积比）的基质中，前10 d控制好光、温和湿度，其成活率可达95%以上（图5）。

3  小结与讨论

在组织培养中，外植体的选择是关键，不同外植体其再生能力有所不同，决定着组织培养的成败与效率。魔芋前期培养污染严重一直是影响魔芋无菌再生体系建立的重要因素，不同来源的外植体应选择其适宜的灭菌处理强度，以达到减少污染且不影响再生的目的。本试验对不同灭菌处理后的魔芋球茎、根状茎及叶柄的愈伤组织诱导能力进行了对比，结果表明根状茎不易灭菌且容易受灭菌剂的影响，导致褐变坏死，但具有较强的脱分化能力，叶柄再生能力低，因此根状茎和球茎都可作为魔芋愈伤组织诱导的理想外植体，其相应最佳灭菌方式为75%乙醇1 min+0.2%HCl2 15 min。

魔芋组织培养中，外源激素种类和不同浓度配比对愈伤组织及不定芽的诱导起着重要作用。本试验发现，细胞分裂素与生长素浓度接近时其愈伤组织诱导率较高，MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA为最佳的魔芋愈伤组织诱导培养基。2.0～2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA或者0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA为魔芋不定芽诱导分化最佳激素组合，但在实际应用中考虑激素TDZ价格因素对生产成本的影响，因此，6-BA更适合应用于魔芋大规模生产中。

有关液体培养应用于魔芋再生体系建立的报道较少。本试验在分化继代培养中对比了液体培养与固体培养的差异，发现液体培养的平均出芽数为4.69，是固体培养的1.85倍，并且液体培养具有降低褐变率、加快愈伤组织生长、提高平均出芽数、培育壮苗的作用，这与胡楠等[9]的研究结果相似。在继代培养时还发现，其继代增殖倍数与接入时的组织状态有关，接入的愈伤组织越好，越利于增殖与分化，接入的愈伤组织较差时，很难形成新的愈伤和分化出不定芽。

魔芋组培苗较易生根，在继代增殖过程中分化出的芽也能形成1～3条根，这有利于魔芋的一次成苗，缩短魔芋组培的时间。试验同时发现，魔芋组培苗的生根情况不但与加入的外源生长调节剂有关，而且与接入时的组培苗关系较大，过多的切除芽基部组织，不利于其生长和生根，很容易导致生根失败和组培苗死亡。因此，进行生根培养时必须给组培苗留一部分组织或小球体。

与其他植物组织培养相比，魔芋组培时的形态发生能力较差，形成有效芽的分化频率较低，同步性差，这些都阻碍了魔芋组培的规模化生产，值得进一步的研究与分析以破解这一难题。

参考文献：

[1] 李  恒.天南星科的生态地理和起源[J].云南植物研究，1986（8）：363-381.

[2] 张盛林，刘佩瑛，张兴国，等.中国魔芋资源和开发利用方案[J].西南农业大学学报，1999（21）：215-219.

[3] 彭述辉，庞  杰.魔芋葡甘聚糖在环保、医药及食品中的应用[J].长江蔬菜，2006（12）：30-33.

[4] 何家庆.论东南亚魔芋资源的利用历史、现状及开发潜力[J].武汉植物学研究，1995，13（3）：269-279.

[5] 胡建斌，柳  俊.魔芋属植物组织培养与遗传转化研究进展[J].中国农学通报，2008，25（1）：14-19.

[6] 戴清堂，陈永波，杨朝柱，等.魔芋组培良种繁育技术体系新进展[J].氨基酸和生物资源，2011，33（3）：34-37.

[7] 胡建斌，柳  俊，严华兵，等.魔芋不同类型愈伤组织及分化能力研究[J].华中农业大学学报，2004，23（6）：654-658.

[8] 胡建斌.魔芋离体形态发生机制及其繁殖技术[D].武汉：华中农业大学，2006.

[9] 胡  楠，刘海利，王启军，等.魔芋浅层液体组织培养体系研究[J].中国蔬菜，2011（10）：58-63.