肉制品中吲哚残留量的高效液相色谱分析

时小艳

摘要：建立一种采用高效液相色谱法（HPLC）测定加工肉制品中吲哚残留量的新方法。样品经纯甲醇提取后，采用HLB固相萃取柱净化，用高效液相色谱C18柱分离，水-乙腈作为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，紫外检测波长为275 nm，外标法定量。吲哚的浓度在10～100 μg/L内有较好的线性关系，R2大于0.99，回收率为93.5%～97.4%，RSD小于15%（n=10）。该法简单，灵敏度高，重复性好，适用于动物源性食品中吲哚残留量的测定。

关键词： 吲哚; 高效液相色谱; 残留

中图分类号：O657.7+2        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-6015-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.056

Content Determination of Indole in Meat Products Processing by HPLC

SHI Xiao-yan

（Department of Career Technical， Jiangsu Food and Drug of Medicine and Health Management College， Huaian 223003， Jiangsu， China）

Abstract： To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for determination of indole residues in meat food， samples were extracted with methanol， purified with HLB solid phase extraction column， separated by C18 chromatography column. Water-acetonitrile was acted as the mobile phase with gradient elution， the flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 30 ℃，the detection wavelength was 275 nm with external standard method. Indole concentration in 10～100 g/L had good linear relationship， regression coefficient was more than 0.99， the recoveries were in the range of 93.5%～97.4%，the relative standard deviation was less than 15%（n=10）. The method was simple， rapid， sensitive， suitable for determination of indole residues in animal origin food.

Key words：indole;high performance liquid chromatography;residues

吲哚是吡咯与苯并联的化合物，又称苯并吡咯，结构如图1所示。熔点在51～54 ℃之间，密度为1.14 g/cm3[1]。吲哚及其同系物和衍生物广泛存在于自然界中，主要存在于天然花油中，如茉莉花、水仙花、香罗兰等中。吲哚是一种重要的有机原料和精细化工产品，是动物必需氨基酸色氨酸的衍生物，植物生长素（吲哚-3-乙酸）、抗炎药物消炎痛、生物碱及色素中也包含有吲哚结构。由于吲哚在化工中被广泛应用，必须控制在允许范围内，避免对人体健康带来威胁[2-4]。

高效液相色谱法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术[5-7]。本试验通过高效液相色谱来测定肉制品中吲哚的含量，该方法简单、可操作性强，灵敏度高。

1  材料和方法

1.1   材料与试剂

食源性肉制品（市售）;吲哚标准品（中国药品生物制品研究所）;甲醇、乙酸乙酯、乙腈（美国Sigma公司）;去离子水（Millipore公司）

1.2   仪器和设备

LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）;Oasis HLB固相萃取柱（3 mL/60 mg，美国Waters公司）;Symmetry C18反相色谱柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm，美国Waters公司）;高速离心机（美国Beckman公司）;

1.3   标准品配制

准确称取吲哚标准品各10 mg（精确至0.001 g），用甲醇分别溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，制备成100 μg/mL的吲哚标准品储备溶液，4 ℃下冰箱保存。

1.4  工作溶液配制

准确量取一定量吲哚标准储备溶液，用甲醇定容于100 mL棕色容量瓶中，分别制备成100、80、40、20、10 μg/L的工作溶液。

1.5  色谱条件

Symmetry C18反相色谱柱; 柱温为30 ℃; 流速为1 mL/min; 进样量为10 μL;流动相：水∶乙腈（65∶35，V/V）;检测波长为275 nm。标准品色谱图见图2

1.6   样本提取

准确称取绞好的动物源性食品5.00 g，放入到50 mL锥形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，超声提取20 min，4 ℃下6 000 r/min离心15 min，吸取上清液。

1.7   样本净化

将HLB固相萃取小柱用5 mL甲醇活化，之后5 mL去离子水平衡，将得到的样品处理液上固相萃取柱（柱流速保持1 滴/s），用10 mL 蒸馏水、10 mL 5%甲醇水溶液淋洗HLB固相萃取柱，再用10 mL甲醇∶乙酸乙酯（15∶85，V/V）洗脱，将洗脱液用60℃氮气吹干后，最后经0.45 μm 滤膜过滤后进样。

1.8   工作曲线和线性关系分析

将配好的吲哚标准工作液，在上述色谱条件下进行上样。将各个工作液对应的峰面积作为纵坐标，将进样浓度作为横坐标，制作标准曲线并且施以外标法定量。计算公式如下：

X=■

式中，C为提取吲哚的浓度，mg/mL;V为样本定容体积，mL;m为样本称取质量，g;X为样本中吲哚的含量，mg/kg。

2  结果与分析

2.1  提取方法的选择

2.1.1  提取溶液的选择  将50%、75%、100%3个甲醇浓度进行提取液比较，在空白样本中分别加入4 μg和8 μg的吲哚，测定回收率，每个样品平行试验8次。

结果表明，以100%甲醇为提取液，回收率水平比其他两组都高，且稳定性更好。因此本试验样品前处理提取液选定为纯甲醇。

2.1.2  净化方法的优化  对于样本中吲哚大多采用固相萃取柱的方法净化，如Merck C18柱、Baker10 C18柱等。本研究中采用甲醇∶乙酸乙酯（15∶85，V/V）作为洗脱液，相比于Merck C18柱、Baker10 C18柱等，HLB固相萃取柱净化效果最好，回收率高。

2.2  色谱条件的选择

2.2.1  最佳柱温的选择  将柱温分别设定为18、25、30、35、40 ℃，其他色谱条件不变，根据峰面积的大小确定最佳柱温，结果见图3。由图可见在30 ℃的柱温条件下，得到最大的峰面积，因此选择了30 ℃作为柱温。

2.2.2  流动相的优化  当只选用30%乙腈作流动相时，各峰的分离度良好，但保留时间较长，并且各色谱峰峰形较宽;而当45%乙腈作流动相时，各峰保留时间变短，但色谱峰的分离度变差，综合考虑，确定乙腈35%作为流动相，从图2可得，在10 min内得到有效的分离，并且基线稳定，不存在拖尾现象。

2.3  标准曲线和线性关系

以峰面积对浓度作校正曲线，得线性回归方程， 发现吲哚在10～100 μg/L内线性关系良好，其线性方程和相关系数如表2和图4所示。

2.4  加样回收率和精密度

分别向适量空白样品中添加高、中和低3种浓度的混合标准溶液，每一水平做10次平行，室温下密封放置2 h，添加水平见表3，按上述样品处理和色谱条件进行回收率及精密度试验。结果可见，回收率为93.5%～97.4%，RSD小于15%，均在允许误差范围内。

2.5  实际样本检测

将上述方法用于3份实际样品的测定，结果如表4所示，样品的平均值为34.79～94.53 mg/kg，RSD为0.3%～1.2%。结果表明，采用以上条件优化得到的检测方法适用于肉制品中吲哚残留量的测定。

3  小结与讨论

本研究探索出了一种基于高效液相色谱仪和HLB固相萃取小柱的测定动物食源性食品中吲哚残留量的新方法。研究结果表明，该方法操作简便，分离完全，3个添加水平的回收率在93.5%～97.4%，RSD小于15%。该方法具有较高的灵敏度和精密度，重复性好，适用于肉类中吲哚残留量的检测， 并可提高检验工作效率和节省检验时间。

参考文献：

[l] 何  燕.吲哚生产应用与开发前景[J].化工中间体，2003（21）：13-15.

[2] 陈明秀，张  卫.气相色谱法测定吲哚含量[J].燃料与化工，2008（3）：49-50.

[3] 李家胜，胡彩虹.高效液相色谱法测定猪皮下脂肪、背最长肌和血清中粪臭素和吲哚的含量[J].分析化学研究简报，2002， 30（6）：736-738.

[4] 王明月.高效液相色谱法测定发酵液中的吲哚乙酸含量[J].热带农业工程，2009，33（5）：1-3.

[5] 冯彦彪.高效液相色谱法在毒物及食品分析中的应用[J].卫生职业教育，2005，23（7）：99-100.

[6] 甘宾宾，汤艳荣，蒋世琼.高效液相色谱-质谱联用技术在食品安全中的应用及进展[J].化工技术与开发，2009，38（12）：33-37.

[7] 郑  天，屠春燕.高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用技术在食品工业上的应用[J].南京工业大学学报，2004，26（2）：99-105.