辽宁省某种猪场氟烷基因的检测

赵世伟 张守纯

生活水平的提高，导致消费者对优质猪肉的要求越来越高，猪肉品质主要受到遗传与环境效应综合作用的影响。目前，猪肉品质已经成为猪种选育的重要指标。氟烷基因（Halothane，Hal）是导致猪应激综合症的一个主效基因，而猪应激综合症直接导致PSE肉或DFD肉的产生。为此，国内外的研究人员对氟烷基因作了细致、深入研究，以降低或消除猪应激综合症导致养猪业的损失，从而提高经济效益，为消费者提供更多的优质猪肉。

研究人员通过对氟烷基因cDNA序列的进一步分析，发现该基因的1843位点的碱基发生了突变（“C”→“T”），而该碱基的突变导致该位点密码子编码的氨基酸由精氨酸变成了半胱氨酸，使得Ca2+释放通道的结构发生了变化，功能也出现了异常。当猪受到应激时，Ca2+会大量的释放，引起肌肉持续收缩产生应激综合征。進一步的研究发现，该位点碱基的突变使得该基因的限制性酶切识别位点由HalN（-5GCG↓C 3-）变为Haln（-5 GTGCT↓G 3-）。

用HhaⅠ酶对该位点酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析后能观察到3种带型，分别为基因型HalNHalN的显性纯合子带型、基因型HalNHaln的杂合子带型以及基因型HalnHaln的隐性纯合子带型，其中基因型为HalnHaln的猪为应激敏感猪。在种猪场氟烷基因的检测中，采用PCR-RFLP技术，既廉价又能准确的检测出Haln的存在，准确率可达100%，检测样本只需采集种猪的少量血液和肌肉组织等。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

PCR基因扩增仪（杭州博日

科技有限公司），电泳槽DYCZ

-25D、电泳仪DYY-10C（北京

六一仪器公司），2×PCR Mast

erMix（康为世纪生物科技有限

公司），HhaⅠ酶、氟烷基因引

物序列（上海生工生物工程有限

公司）：F（5-TCCAGTTT

GCCACAGGCCA-3）、R（

5-ATTCACCGGATGG

AGTCTCTGAG-3）。

1.2 材料

辽宁省某种猪场312头种猪的耳组织（绿豆粒大小）。

1.3 方法

本试验使用经典的酚—氯仿法提取312头种猪耳组织的总基因组DNA，提取完成的总基因组DNA充分溶解于灭菌去离子水中后，于-20℃保存备用。

1.3.1 Hal基因PCR扩增反应体系（20微升）10微升 2×PCR MasterMix，2微升猪耳组织的总基因组DNA，上游引物和下游引物各1微升，6微升超纯去离子灭菌水。Hal基因PCR扩增反应条件为：94℃预变性5分钟，30次循环（94℃，45秒；58℃，45秒；72℃，45秒），最后72℃10分钟。Hal基因的PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果为阳性的PCR扩增产物进行酶切。

1.3.2 酶切反应体系 （15微升）HhaⅠ酶1微升，10×Buffer 1.5微升，Hal基因的PCR扩增产物10微升，灭菌去离子水2.5微升。在37℃水浴中孵育4小时后，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

猪基因组总DNA1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，本试验提取的基因组总DNA纯度较高，且浓度较大（见图1）。1%的琼脂糖凝胶电泳检测的Hal基因PCR扩增产物条带大小约为659bp（见图2），与目的条带一致，而且无非特异性条带的出现。

Hal基因酶切产物的电泳结果存在3种带型（见图3），即基因型为HalNHalN的显性纯合子带型（2条带：493bp、166bp）、基因型为HalNHaln的杂合子带型（3条带：659bp、493bp和166bp）以及基因型为HalnHaln的隐性纯合子带型（1条带：659bp）。本试验检测的312头种猪中基因型为HalnHaln的隐性纯合子3头，基因型为HalNHaln的杂合子34头，其余均为HalNHalN的显性纯合子。含有Haln基因的种猪头数占检测猪群的11.9%，Haln基因频率为6.4%。

3 讨论与结论

在养殖过程中，基因型为HalNHalN的显性纯合子不表现应激综合征，基因型为HalnHaln的隐性纯合子表现出应激综合征，而基因型为HalNHaln的杂合子，则部分表现为应激综合征。因此，在养殖过程中简单的通过应激综合征的表现来决定种猪的选留并不能从根本上淘汰Haln基因，而本试验采用的检测技术能从分子水平准确的判断种猪的选留，保障养猪业的经济效益。

由于本猪场的种猪大部分为引进猪种，说明在引种的过程中引入Haln基因，该基因在后续的扩繁中将会直接影响该种猪场的经济效益，需要及时淘汰携带Haln基因的种猪。并建立完善的种猪繁育体系，生产高品质、高性能的商品猪，为消费者提供更优质的猪肉。