Fe(Ⅲ)—KI—RB体系荧光猝灭法间接测定微量铁

董文丽 徐 刚

(重庆科技学院，重庆 401331)

铁是人体必需的微量元素之一，可以参与血蛋白，细胞色素及各种酶的合成［1，2］。生物医学研究证明［3］，微量元素的浓度与人体健康之间具有越来越多的相关性，因此研究测定食品中微量铁具有重要意义。微量铁的测定方法主要有原子吸收光谱法［4，5］、分光光度法［6］、伏安法［7］、高效液相色谱法［8］、荧光分析法［9，10］等。中国 GB/T 5009.90—2003《食品中铁、镁、锰的测定》采用火焰原子吸收法，但由于该法灵敏度不高，对于一些铁含量较低的样品分析受到限制。而荧光分析法以其灵敏度高、选择性好及操作简便等优点，广泛应用于环境水样［11］、食品［12］及药品［13］中微量铁的测定。罗丹明B(rhodamine B，RB)属于“三苯甲烷类”试剂，本身具有很强的荧光性及络合能力，可以跟许多物质反应形成离子缔合物，导致RB分子本身的内源性荧光发生猝灭，从而实现对某些阴阳离子的检测分析。迄今尚未有关于RB荧光猝灭法测定微量铁的研究报道，本研究拟根据在盐酸介质中，Fe3+与过量KI反应后生成I3－，I3－与RB形成离子缔合物，使RB分子內源性荧光发生猝灭，荧光猝灭值的大小与体系中Fe3+浓度在一定范围内成正比，从而建立起Fe(Ⅲ)—KI—RB体系荧光猝灭法间接测定微量铁的新方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

荧光光谱仪:LS55型，美国PE公司;

高通量密闭微波消解系统:CEM MARS型，美国培安科技公司;

原子吸收分光光度计:AA-702型，北京东西分析仪器有限公司(仪器使用条件:灯电流5 mA，光谱通带0.2 nm，波长248.5 nm，燃烧器高度6 mm);

电子天平:BP211D型，德国赛多利斯公司;

浓盐酸、30%过氧化氢:优级纯，成都金山化学试剂有限公司;

聚乙烯醇 PVA-124、乳化剂OP-10、罗丹明B:分析纯，重庆川东化学试剂厂;

RB溶液(储备液):1.0×10－3mol/L，使用时稀释至 1.0 ×10－5mol/L;

铁标准溶液(100 μg/mL):准确称取 0.014 3 g Fe2O3(99.99%)于100 mL烧杯中，加入5 mL HCl(6 mol/L)溶解后转移至100 mL容量中，用一级去离子水稀释至刻度，摇匀，此溶液为100 μg/mL的铁(III)标准溶液，使用时稀释成1 μg/mL的铁工作液;

生花生:2013年8月采集于贵州务川;

试验用水为一级去离子水，所用试剂除特别说明外，均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 激发波长和发射波长的选择 于25 mL比色管中分别加入1 μg/mL 铁标准工作溶液0.00，4.00 mL，10%的碘化钾溶液1.00 mL，1 mol/L 的 HCl 2.00 mL，混匀后稀释至 10 mL，静置10 min后，再加入 1.0 ×10－5mol/L RB 溶液2 .00 mL，10 g/L 的 PVA-124 溶液0.50 mL，微乳液 0.50 mL，摇匀，然后用去离子水稀释至25 mL，放置10 min，用荧光光谱仪分别扫描空白及离子缔合物的激发波长和发射波长，确定体系的荧光最大激发波长和最大发射波长。

1.2.2 盐酸用量的选择 吸取1 μg/mL铁标准工作溶液0.00，4.00 mL于25 mL比色管中，其它试剂固定不变，只改变盐酸的用量(加入 1 mol/L 的 HCl溶液 0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL)，分别测定空白荧光强度 F0及离子缔合物溶液的荧光强度F，按式(1)计算荧光猝灭值ΔF，以ΔF对盐酸用量绘制曲线，确定盐酸的最佳用量。

1.2.3 碘化钾用量的选择 其它试剂不变，分别加入10%的碘化钾溶液 0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL，测定空白荧光强度F0及离子缔合物溶液的荧光强度F，按式(1)计算荧光猝灭值ΔF，以ΔF对碘化钾用量绘制曲线，确定碘化钾的最佳用量。

1.2.4 罗丹明B用量的选择 其它试剂不变，分别加入1.0 ×10－5mol/L 的罗丹明 B 溶液 0.50，1.00，1.50，2 .00，2.50，3.00 mL，测定空白荧光强度 F0及离子缔合物溶液的荧光强度F，按式(1)计算荧光猝灭值ΔF，以ΔF对罗丹明B用量绘制曲线，确定罗丹明B的最佳用量。

信息类试题往往是生物学考试中得分率较低、区分度较大的试题。学生往往读不懂题干信息，不知道如何利用信息作答。之所以出现这两个问题，根本原因是学生缺乏获取和解读信息的能力、调动和运用知识的能力。

1.2.5 表面活性剂的选择 其它试剂不变，分别加入不同种类、不同量的表面活性剂，测定空白和离子缔合物的荧光强度，确定表面活性剂的种类及最佳用量。

1.2.6 标准曲线的绘制 于25 mL比色管中分别加入1 μg/mL铁标准工作溶液 0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50，4.00，4.50 mL，10% 的碘化钾溶液 1.00 mL，1 mol/L的HCl 2.00 mL，混匀后稀释至10 mL，静置10 min后，再加入1.0×10－5mol/L RB溶液2.00 mL，10 g/L的 PVA-124溶液0.50 mL，微乳液0.50 mL，摇匀，然后用去离子水稀释至25 mL，放置10 min，用1 cm比色皿，以水作参比，于波长λex/λem=352 nm/580 nm处测量试剂空白荧光强度F及离子缔合物溶液的荧光强度F，按式(1)计算荧光猝灭值ΔF，以ΔF对铁(Ⅲ)质量绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 激发光谱和发射光谱

由图1可知，在表面活性剂PVA-124和微乳液存在下，体系的最大激发波长为352 nm，最大发射波长为580 nm。KI—RB体系的激发和发射光谱(曲线1和3)荧光值明显比Fe(Ⅲ)—KI—RB体系(曲线2和4)的荧光值高，说明KI本身不与RB反应形成离子缔合物，但当体系中有Fe3+存在时，Fe3+可与KI反应生成I2，I2再与过量的KI反应生成I3一，I3一与RB形成离子缔合物，使RB分子内源性荧光发生猝灭，导致RB分子的荧光强度降低的结果。

图1 荧光激发和发射光谱Figure 1 Excitation and emission spectra of fluorescence

2.2 酸度的影响

试验考察了不同浓度的HCl溶液对体系荧光猝灭值的影响见图2，结果表明，当加入1 mol/L HCl为2.00 mL时荧光猝灭值最大且稳定。因此，本试验选择1 mol/L HCl溶液为 2.00 mL。

2.3 碘化钾用量试验

试验考察了0.1 mol/L KI溶液加入量对体系荧光猝灭情况的影响见图3。体系的荧光猝灭情况先随KI的加入量逐渐增加，当加入 KI的量为1.00 mL时最大，但超过1.00 mL时又逐渐减小，这是因为Fe3+与过量KI反应后生成I3－，I3－与RB形成离子缔合物，使RB分子内源性荧光发生猝灭，但碘化钾浓度太大时，单位体积内有效I3－相对较少，使RB分子內源性荧光猝灭效应相对减弱。因此，本试验选用KI加入量为1.00 mL。

图2 盐酸用量曲线Figure 2 Curve of hydrochloric acid used amount

图3 碘化钾用量曲线Figure 3 Curve of potassium iodide used amount

2.4 罗丹明B用量的影响

试验考察了不同量RB对体系荧光猝灭的影响见图4。试验表明，荧光猝灭值随RB溶液的增加而增大，当RB溶液增加到2.00 mL时，荧光猝灭值最大且灵敏度最高;当RB的用量超过2.00 mL后体系的荧光猝灭值逐渐减小，检测的灵敏度降低，这可能是由于过量RB对于激发光的吸收具有隐蔽效应所致。因此，本试验选择RB最佳用量为2.00 mL。

图4 罗丹明B用量曲线Figure 4 Curve of Rhodamine B used amount

2.5 表面活性剂的影响

试验考察了阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTMBA)、阿拉伯树胶、明胶、司班-40、司班-60、PVA-124、微乳液(VOP-10∶V正戊醇∶V正庚烷∶V水=3.2∶2.3∶0.5∶94)对体系荧光猝灭值的影响，试验表明，当同时加入0.5 mL PVA-124(10 g/L)和0.5 mL微乳液时，体系荧光猝灭值最大且稳定。

2.6 干扰离子

当测定0.08 μg/mL铁，相对误差＜5%时，允许干扰离子的倍数为:1 000倍的Ca2+、Al3+;500倍的NH4+;400倍的F－;300倍的C2O42－;50倍的Cd2+、Mn2+;2倍的Cr(VI);0.5倍的 Cu2+;Na+、Mg2+、K+、Cl－、NO3－不干扰测定。

2.7 线性范围及检测下限

按(1.2.6)试验方法分别测定不同量的铁加入后的荧光强度F和空白的荧光强度F0，以ΔF为纵坐标，以铁的质量为横坐标绘制标准曲线，曲线的回归方程为ΔF=21.968C+4.176 9，铁含量在0.02～4.50 μg/25 mL 范围内与 ΔF 呈良好的线性关系(见图5)，相关系数为 γ=0.999 2，以空白的3倍标准偏差除以工作曲线的斜率得本方法的检测下限为0.006 μg/25 mL。

图5 标准曲线Figure 5 Standard curve

3 样品分析及回收率测定

将花生置于105℃干燥箱中烘至恒重后研磨成粉末，准确称取1.000 0 g粉末样品于微波消解罐中，加入浓硝酸10 mL，30%过氧化氢2.0 mL，按照程序升温进行消解(微波程序升温为:0～60℃，升温2 min，停留1 min;60～120℃，升温6 min，停留3 min;120～180℃，升温6 min，停留10 min，微波功率为800 W，效率为100%)，消解完毕后取出罐体，冷却至室温，将消解液转移至小烧杯中低温加热蒸至近干，取下加水溶解盐类，然后转移至50 mL容量瓶中，稀释至刻度摇匀备用。

移取5.00 mL样品试液于25 mL比色管中，其余所加试剂按试验方法进行。用1 cm比色皿，以水作参比，于波长λex/λem=352 nm/580 nm处测量样品溶液的荧光值F，计算荧光猝灭值ΔF，同时做加标回收试验，试验结果见表1。

表1 样品测定结果Table 1 Determination results of samples(n=5)

4 结论

本试验对Fe(Ⅲ)—KI—RB缔合物荧光猝灭体系进行了研究，优化了体系的测量条件，并将该方法用于花生中微量铁的测定，结果与原子吸收法［14］基本一致;方法具有较高的灵敏度，检测下限低，可用于水样、食品及中药材中微量铁的测定;由于体系所用的RB试剂具有较强的荧光特性，因此，要求测量者必须具有熟练的加液操作技能，否则会给样品测定带来误差。

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