液相色谱－串联质谱法测定卷烟中的黄曲霉素

陈伟华

（河北中烟工业有限责任公司，河北 石家庄 050051）

黄曲霉素（aflatoxin，AFT）是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的真菌毒素，为二氢呋喃香豆素的衍生物，目前发现的黄曲霉素主要有B1、B2、G1、G2、M1、M2等几种。其中，B1的毒性最强［1］，M1、M2主要存在于牛奶中［2－3］。人体摄入黄曲霉素后，通过破坏肝脏组织引起急、慢性中毒，长期摄入会诱发癌症。近年来，AFB1污染事件的发生已引起世界各国对食品安全的关注［4－6］。美国、欧盟等国家对食品中黄曲霉素的含量进行了严格限制，我国也已颁布食品和乳制品中黄曲霉素的检测标准，并对其含量作了严格规定。

卷烟是一种以吸食为主要目的的快速消费品，其质量卫生安全日益受到人们的重视。一直以来，不法分子为牟取暴利，以低等级和霉变烟叶作为原料，通过硫磺熏蒸［7］或使用其他非法添加物等手段，改善烟叶外观，以假乱真，蒙蔽消费者，严重损害了国家和消费者的利益。另外，因储存不当，易致烟叶或卷烟发生霉变［8－10］。卷烟霉变后，不但燃烧性和吸味质量显著下降，而且对人体会造成潜在危害。目前，黄曲霉素的测定方法主要有薄层层析法（thin layer chromatography）［11］、免疫亲和柱净化液相色谱 法 （immune affinity column cleanse，HPLC）［12－13］、酶 联 免 疫 法 （enzyme－linked immune sorbent assay）［14－15］、高 效 液 相 色 谱－串 联 质 谱 法（high performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry）［16］等，这些方法要么前处理繁琐，要么不易单一定量或出现假阳性。HPLC法具有快速准确、灵敏度高、检出限低等优点，近年来得到快速发展和广泛应用，配合质谱联用技术，可实现对大部分化合物的分离和准确定量。目前，国外对烟草及其制品中的黄曲霉素的测定已有相关研究报道［17－19］，但在占世界卷烟消费1／3的中国还未见报道。因此，准确测定卷烟中的黄曲霉素，可对疑似霉变烟叶和卷烟的处理提供依据和参考。

1 实验部分

1.1 方法原理

样品以三氯甲烷萃取，净化并浓缩后，在选定的仪器参数下，进行液相色谱－质谱分析。采用对照标准品的保留时间和特征碎片离子定性，外标标准曲线法定量。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪；Agilent 6430三重四极杆质谱仪，Paker NitroFlowLab氮气发生器；Millipore Milli－Q 超纯水制备系统；Binder FD53热风干燥箱；AG285型电子天平（感量0.000 1g）；KQ－700型超声波清洗机；RE－52AA型旋转蒸发仪。

黄曲霉素 M1、M2、G1、G2混标（混合标准溶液）supelco；甲醇、异丙醇、三氯甲烷、正己烷，色谱纯，dikma；乙酸铵，优级纯，国药试剂；硅胶SPE柱，agilent，500mg／（5mL）；烟叶样品取自仓库，卷烟样品购自市场。

1.3 样品制备与净化

按YC／T 31－1996要求制备试样。称取研磨好的试样5.0g，置于50mL具塞锥形瓶中，加入20mL三氯甲烷，超声提取30min。过滤，收集滤液于带有刻度尾管的浓缩瓶内，并用三氯甲烷洗涤滤渣，收集清洗液。用旋转蒸发仪将上述滤液在50℃水浴中浓缩至约1mL，加入4mL正己烷混匀，注入活化好的硅胶SPE小柱中。依次用5mL正己烷、5mL三氯甲烷淋洗，弃去流出液。然后，用10mL三氯甲烷－甲醇溶液（体积比为9∶1）分2次洗脱，收集洗脱液于带有刻度尾管的浓缩瓶内。在氮气保护，50℃水浴条件下，用旋转蒸发仪将样品浓缩至0.5mL。待液相色谱、质谱分析。

1.4 标准溶液配制

用甲醇将黄曲霉素混标稀释为系列标准溶液，各目标化合物质量浓度如表1所示。

表1 黄曲霉素标准溶液质量浓度 ng／mL

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

进样量：10μL；色谱柱：Zorbax SB－C18（2.1×50mm，1.8μm）；柱温：45℃；流速：0.5mL／min；流动相：A——10mmol／L 乙酸铵－水溶液，B——10mmol／L乙酸铵－甲醇溶液；梯度洗脱：0minw（B）＝5%、10minw（B）＝40%、15minw（B）＝100%、20minw（B）＝100%，后运行5min。

1.5.2 质谱条件

离子源：ESI；干燥气温度：325℃；干燥气流量：10L／min；雾化器压力：344.75kPa（50psi）；毛细管电压：4 000V；采集方式：MRM；三重串联四极杆液质多反应监测模式（MRM），参数见表2。

表2 MRM采集参数表

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

以乙腈－水为流动相时，乙腈抑制黄曲霉素化合物离子化导致质谱信号降低，并且色谱峰出现拖尾现象。以甲醇－水作为流动相，质谱信号提高，峰形对称。实验在甲醇－水中添加乙酸铵提高质谱灵敏度，当流动相中乙酸铵的浓度达到10mmol／L时质谱信号最强。采用梯度洗脱条件，4种黄曲霉素在13min内即达到较好的分离效果。因此，本实验选择甲醇－乙酸铵混合体系作为流动相。标准样品色谱图和实际样品色谱图见图1和第31页图2。

图1 标准样品色谱图

图2 实际样品色谱图

由于黄曲霉素化合物分子结构中羰基具有强的电负性，有利于分子获取氢离子，因此选择正离子扫描较合理。同时，实验考察了正、负离子扫描方式对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2灵敏度的影响。结果显示，正离子扫描模式下质谱信号明显高于负离子扫描。然后，利用安捷伦自动参数优化软件（mass hunter optimizer）可以自动得到每个待测组分的最佳碰撞电压和碰撞能，并确定最优的子离子。

2.2 样品提取和净化

实验考察了超声和振荡2种方式对4种黄曲霉素的提取效果。在5.0g烟末样品中加入1.0mL 4种黄曲霉素的混标溶液，待溶液完全被样品吸收后，再分别用乙酸铵水溶液、甲醇、异丙醇、三氯甲烷进行超声波，振荡提取，测定4种待测物。结果发现，乙酸铵的提取效果不好；甲醇和异丙醇的提取液颜色较深，回收率在120%～200%；而用三氯甲烷提取时，样品中4种待测物的干扰较小，回收率在70%～103%，故选三氯甲烷作为提取剂。经实验，确定用20mL三氯甲烷，超声提取30min即可达到较好的效果。

烟草中含有几千种化学成分，其提取物基质较为复杂，且黄曲霉素的检测在痕量范畴，因此，要通过合适的净化方式去除干扰。查阅相关文献，常用的净化方法有传统固相萃取法、免疫亲和固相萃取法以及多功能净化柱法，这几种方法均有着各自的优缺点。传统固相萃取处理过程复杂，但回收率和精密度较好；免疫亲和柱和多功能净化柱处理过程相对简单，但价格昂贵、不易保存、易失效，且回收率和精密度不如传统固相萃取。因此，本实验选用SPE固相萃取柱净化提取液。

2.3 标准曲线及检出限

对1.4中所配制的标准溶液按1.5所述仪器条件进行检测，以质量浓度X（ng／mL）对峰面积Y进行线性回归，计算标准曲线；将最低浓度的标准溶液重复进样10次，其3倍标准偏差为检出限。结果如表3所示。

表3 4种黄曲霉素的线性方程与检出限

2.4 精密度与回收率

按高、中、低3个加入水平，向不含黄曲霉素的空白试样中加入黄曲霉素混标，每个加标水平进行6次平行测定，结果见第32页表4。结果表明，采用本方法对空白样品加标实验，除黄曲霉G2的回收率较低为66.3%～70.7%，这可能是由于G2的测定重复性较差所致外，其他3种的平均回收率均在85.0%以上，且重复性小于10%。说明本方法比较可靠。

2.5 实际样品检测

用本方法对部分假冒卷烟或可疑霉变卷烟及烟叶样品进行了检测，结果见第32页表5。正常卷烟中未检出黄曲霉素；部分可疑霉变烟叶中检出B1，个别假冒卷烟中检出G1，但含量均低于5μg／kg。

3 结论

采用液相色谱－质谱联用法对烟草中黄曲霉素的含量进行了检测，方法重复性较好，检出限低，快速准确，适合可疑霉变烟叶和卷烟中黄曲霉素的同时快速测定。

表4 精密度与加标回收率

表5 部分假冒伪劣卷烟黄曲霉素的含量 μg／kg

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