炎症因子TNF-α、IL-6 和IL-4 在溃疡性结肠炎中的表达及临床意义

王少鑫，浦 江，刘超群，李 超，闫志辉，崔立红

海军总医院消化内科，北京100048

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种原因不明的慢性非特异性炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，据流行病学调查结果表明，发病率在世界范围内呈逐年升高的趋势，目前认为UC 与感染、环境、免疫以及遗传等多种因素有关，但具体机制尚不清楚，有报道免疫调节机制中炎症细胞因子在UC 的发病中可能发挥重要作用［1］。本研究旨在通过动物模型及人类血清样本检测，进一步探讨促炎因子IL-6、TNF-α 和抑炎因子IL-4 的表达在UC 病情进展中具有的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床样本:收集2011 年4 月-2013 年8 月海军总医院门诊或住院UC 患者62 例作为研究对象，男25 例，女37 例，年龄25 ～64 岁，平均年龄(41. 8 ±13.2)岁，入选患者均符合中华医学会消化病分会2007 年制定的UC 诊断标准［2］，并行结肠镜检查。结合临床症状，将UC 患者分为活动期组(44 例)和缓解期组(18 例)，并按疾病的严重程度将患者分为轻度组(16 例)、中度组(17 例)和重度组(11 例)。选取同期健康体验者26 名作为对照者(对照组)，男10 例，女16 例，年龄24 ～66 岁，平均年龄(42.68 ±14.2)岁。UC 患者与健康对照者年龄及性别构成相比，差异无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。所有患者均排除其他肠道感染性疾病、肿瘤、风湿及其他自身免疫病。所有研究对象均签署知情同意书，本研究经海军总医院伦理委员会批准。所有研究对象均于清晨抽取静脉血10 ml，肝素抗凝，4 ℃保存，3 000 r/min，离心10 min，分离血清，-80 ℃冻存待测。

1.1.2 动物组织样本:选取军事医学科学院动物中心C57BL/6 雄性小鼠共10 只，周龄6 ～8 周，体质量22～24 g 进行UC 动物模型建立。具体方法:给C57BL/6 雄性小鼠服用2.5%葡聚糖硫酸钠盐(dextran sodium sulfate，DSS)饮水，持续给药6 d 后处死小鼠，随后将结肠组织采用Swiss-roll 的方式翻卷成年轮状置于10%甲醛中固定，备用于病理学苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)染色;同时取直肠末端及结肠近端各5 mm 结肠组织，置于1 ml Trizol 中于-80 ℃冰箱内保存，待行实时荧光定量PCR 检测(RT-PCR)。

1.2 试剂 逆转录试剂盒DRR041A 和PCR 反应试剂盒DRR081A 均购自TakaRa 公司。IL-6、IL-4 及TNF-α ELISA 检测试剂盒均购自深圳达科为公司(DKW12-1040-048，DKW12-1728-048)。

1.3 检测方法

1.3.1 ELISA 检测:将所有贮存的人血清样本同一时间进行ELISA 检测，操作步骤按照ELISA 检测试剂盒说明书进行。

1.3.2 HE 染色:对小鼠结肠炎组织样本固定24 h 后进行石蜡包埋，并3 μm 厚连续切片，行常规HE 染色。1.3.3 RT-PCR 检测:对UC 动物模型直肠末端及结肠近端组织样本进行RT-PCR 检测，均按照TakaRa 试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计软件进行分析，计量资料用s 表示，多组间比较采用t 检验或单因素方差分析，P ＜0.05 为差异有统计意义。

2 结果

2.1 小鼠UC 动物模型病理组织学鉴定 小鼠UC模型结肠组织病理学HE 染色证实UC 模型构建成功;结直肠为UC 的好发部位，可见结直肠末端黏膜大量剥落，有溃疡形成，黏膜下组织有大量淋巴细胞和浆细胞浸润，符合UC 病理组织学表现;而结肠近端结肠组织黏膜平滑，无溃疡形成，黏膜层和黏膜下层均未见明显炎性细胞浸润，基本属于正常结肠组织。因此，病理学支持结直肠末端为UC 炎症组织，而结肠近端为大致正常结肠组织(见图1)。

图1 UC 小鼠模型(10 ×) A:结直肠末端为结肠炎症组织(200 ×);B:结肠近端为大致正常结肠组织(200 ×)Fig 1 UC model (10 ×) A:inflammation tissue in distal colon(200 ×);B:normal tissue in proximal colon (200 ×)

2.2 小鼠结肠组织中炎症因子TNF α、IL-6 和IL-4的mRNA 表达水平 取小鼠UC 模型结直肠炎症组织(结直肠末端)及结肠近端组织(大致正常结肠组织)进行RT-PCR 检测，发现炎症组织中IL-6、TNF-α mRNA 表达水平明显高于正常组织(P ＜0.05)，分别大约为正常组织的16 倍和70 倍，而IL-4 mRNA 表达水平明显低于正常组织(P ＜0.01)，约为正常组织的1/20 倍(见图2)。

图2 小鼠UC 模型结肠炎症组织与正常组织中TNF-α、IL-6 和IL-4 的mRNA 表达水平Fig 2 The expressions of TNF-α，IL-6 and IL-4 mRNA in normal and colitis tissue of UC model mice

2.3 UC 患者血清中细胞因子TNF-α、IL-6 和IL-4的水平 活动期UC 患者血清TNF-α、IL-6 水平均明显高于对照组和缓解期组(P ＜0.05)，且升高水平与结肠炎症严重程度呈正相关;活动期UC 患者IL-4 水平明显低于对照组和缓解期组(P ＜0.05)，且降低水平与结肠炎症严重程度呈负相关。对照组与缓解期UC 患者的炎症因子水平相比，差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

表1 UC 患者血清TNF-α、IL-6 和IL-4 表达水平(s)Tab 1 Expression of serum TNF-α，IL-6 and IL-4 in UC patients (s)

表1 UC 患者血清TNF-α、IL-6 和IL-4 表达水平(s)Tab 1 Expression of serum TNF-α，IL-6 and IL-4 in UC patients (s)

注:与对照组、缓解期组相比，* P ＜0.05;与对照组、缓解期组比较，▲P ＜0.01。

例数 IL-6(pg/ml)TNF-α (ng/L)IL-4(pg/ml)26 12.2 ±3.3 5.8 ±1.2 22.8 ±2.6缓解期组 18 16.8 ±4.7 6.9 ±1.8 18.2 ±2.9活动期组 44 165.3 ±42.6* 17.6 ±6.4* 6.5 ±1.6*轻度 16 108.2 ±41.2 12.6 ±3.7 8.7 ±1.9中度 17 162.4 ±32.8▲16.9 ±7.8▲ 6.9 ±1.3▲重度 11 222.4 ±56.8▲22.8 ±9.2▲ 4.1 ±0.9对照组▲

3 讨论

近年来，世界范围内IBD 的发病率持续升高，在发展中国家尤为明显。尽管饮食和环境因素可能影响了IBD 的发病率，但具体病因和发病机制仍不明确。目前，免疫调节因素在IBD 发病中的作用日益受到关注。IBD 中许多常见的免疫反应受炎症细胞因子介导，但这些小肽分子的确切致病机制尚不明确，认为在肠黏膜中促炎和抑炎细胞因子保持平衡对于肠道生态平衡的维持是非常重要的［3］，促炎细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1、IL-12、IL-23 等的过度产生和抑炎因子如IL-4、IL-10、IL-19、IL-22 等生成不足，导致肠道内环境紊乱是促使IBD 发生的重要环节［4］。

TNF-α 是IBD 病理进程中的关键细胞因子，通过表达黏附分子、成纤维增殖因子、凝血因子以及启动细胞毒性、凋亡和急性期反应等过程发挥作用。TNF-α的血清水平与UC 和克罗恩病(Crohn's disease，CD)的临床活动有关［5］，抗TNF 抗体广泛应用于IBD 治疗并取得良好效果，进一步证实了TNF-α 在结肠炎症致病中的关键作用。

IL-6 是一种免疫调节细胞因子，在炎症反应中启动了细胞表面信号复合体(包括IL-6、sIL-6R 及共享信号受体gp130)发挥作用。在UC 发病机制及随后的UC 相关结肠癌肿瘤形成中，IL-6 主要通过STAT3 信号通路发挥重要作用［6］。而且Mitsuyama 等［7］发现sIL-6R 水平在活动期UC 和CD 患者较非活动性疾病患者中明显升高，血清IL-6 和sILR 水平与CRP 水平密切相关。基于这些数据，阻断IL-6/STAT3 信号通路以及应用IL-6R 抗体很有可能成为未来充满希望的治疗手段。

IL-4 是一种抗炎因子，通过刺激B 细胞和T 细胞，在结肠中发挥免疫抑制效应［8］。IL-4 和IL-10 均能够通过下调炎性介质包括TNFα 和IL-1 等，促进体液免疫反应［9］。在直肠炎中，IL-4 和IL-10 共同作用下能够逆转Th1/Th2 细胞活化过程，进而增强Th2 型反应，最终改善黏膜修复。提示在结肠炎症进展过程中，抑炎因子IL-4 水平的降低，可能导致了抑炎作用减弱，进而加重了结肠炎症反应。

本实验通过UC 动物模型的构建及mRNA 水平的检测，表明在动物体内局部结肠黏膜促炎症因子的大量聚集以及抑炎因子的表达减少可能促进了结肠炎症的进展。而且在人血清标本检测中也证实，随着结肠炎症程度的增加，血清中促炎因子和抑炎因子的表达水平呈相反方向发展，与病情进展相关，这些结果均提示抑炎因子和促炎因子的表达失衡可能在结肠炎症发生、发展中发挥重要作用。因此，血清炎症因子水平检测可能成为临床UC 严重程度的评估标准，对临床诊断和病情监测具有重要的临床意义。

［1］ Pedersen J，Coskum M，Soen dergaard C，et al. Inflammatory path ways of importance for management of inflammatory bowel disease［J］.Wold J Gastroenterol，2014，20(1):64-77.

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［4］ Pichai MV，Ferguson LR. Potential prospects of nanomedicine for targeted therapeutics in inflammatory bowel diseases［J］. World J Gastroenterol，2012，18(23):2895-2901.

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［6］ Li Y，de Haar C，Chen M，et al. Disease-related expression of the IL-6/STAT3/SOCS3 signalling pathway in ulcerative colitis and ulcerative colitis-related carcinogenesis［J］. Gut，2010，59(2):227-235.

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