水通道蛋白9 在便秘型肠易激综合征患者结肠黏膜表达的研究

王晓玲，李 汀，江 梅

西安市第四医院消化内科，陕西 西安710004

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是临床上常见的一种胃肠功能紊乱性疾病，以腹痛伴排便习惯改变为特征，根据罗马Ⅲ诊断标准，IBS 可分为4 型，即便秘型肠易激综合征(C-IBS)、腹泻型肠易激综合征(D-IBS)、混合型肠易激综合征(M-IBS)及未定型肠易激综合征，临床诊断依据各种临床症状，并排除器质性疾病［1-2］。目前发病机制尚不明确，认为与多种因素有关，其中腹泻、便秘症状的出现与水代谢紊乱密切相关。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是特异性转运水的蛋白家族，参与机体水的分泌、吸收及细胞内外水平衡的调节，已有研究发现水通道蛋白9(aquaporin9，AQP9)在人结肠有表达，且与功能性便秘密切相关［3］。本研究通过运用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测C-IBS 患者升、降结肠黏膜AQP9 mRNA 的表达，分析AQP9 与IBS 的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011 年6 月-2013 年6 月于西安市第四医院内镜中心行结肠镜检查，通过详细询问病史、结合临床症状、体格检查、粪常规检查等排除肠道器质性病变，确诊为C-IBS 患者41 例，女28 例，男13 例，年龄21 ～69 岁，平均年龄(43.09 ±1.01)岁。IBS 的诊断标准参考2006 年RomeⅢ［4］。正常对照组选取健康体检者29 例，男11 例，女18 例，年龄25 ～61 岁，平均年龄(43.01 ±0.91)岁，所有受检者均签署知情同意书。肠镜下取C-IBS 和正常对照组升结肠和降结肠黏膜组织各2 块，立即投入液氮中冷冻储存，以备RT-PCR 实验用。

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂及仪器:RT-PCR 试剂盒(MBI Fermentas 公司);Trizol 试剂(Invitrogen 公司);DNA Marker(上海生物工程技术服务有限公司);琼脂糖(北京奇松生物科技有限公司);全自动PCR 扩增仪(美国ABI 公司);GDS7500 图像分析系统(英国UVP公司);UV-2602 型紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司);超声波细胞粉碎机(美国Sonics);电泳仪(Biochrom 公司);超低温冰箱(Thermo 公司);离心机(德国Sigma 公司)。

1.2.2 RT-PCR:取出液氮中冻存的结肠黏膜组织，按照Trizol 试剂盒说明书提取组织中的总RNA，然后按照逆转录试剂盒说明书对其进行逆转录。根据NCBI的Genbank 查找AQP9 cDNA 序列号，选用GAPDH 基因为内参照引物基因，所有引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列如下:GAPDH 上游引物:5＇-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3＇，下 游 引 物:5＇-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3＇，扩 增 产 物 为308 bp。AQP9 上 游 引 物:5＇-GATGCCTTCTGAGAAGGACA-3＇，下游引物:5＇-CGATGCTCTTGGTATTGGCT-3＇，扩增产物为218 bp。GAPDH 反应条件为94 ℃20 min，58 ℃30 min，72 ℃30 min，共35 个循环;AQP9 反应条件为94 ℃20 min，58 ℃30 min，72 ℃30 min，共36 个循环。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳及半定量分析:取出PCR 扩增产物5 μl，置于1%琼脂糖凝胶中(含0.15 μg/ml 溴化乙啶)，TBE 电泳缓冲液中4 V/cm 电压电泳60 min，用GDS7500 图像分析系统进行密度扫描定量，以AQP9 基因与GAPDH 比值表示AQP9 mRNA 的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行分析，计量资料用±s 表示，数据经正态检验呈正态分布，采用两个独立样本t 检验，P ＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

正常对照组及C-IBS 组升、降结肠均有AQP9 mRNA 表达，正常对照组降结肠AQP9 mRNA 表达量高于升结肠(P ＜0.01);C-IBS 组降结肠表达量低于升结肠(P ＜0.05)，经过两独立样本的t 检验，C-IBS 组升、降结肠黏膜组织中AQP9 mRNA 表达量均较正常对照组降低，但降结肠降低更为显著，差异有统计学意义(P ＜0.01)，而升结肠降低不明显，差异无统计学意义(P ＞0.05，见表1、图1)。

表1 C-IBS 组与正常对照组升、降结肠AQP9 mRNA 表达量比较(±s)Tab 1 Comparison of expression of AQP9 mRNA between C-IBS group and control group (±s)

表1 C-IBS 组与正常对照组升、降结肠AQP9 mRNA 表达量比较(±s)Tab 1 Comparison of expression of AQP9 mRNA between C-IBS group and control group (±s)

组别 例数 升结肠 降结肠 t 值 P值41 0.499 ±0.011 0.457 ±0.023 2.104 ＜0.05正常对照组 29 0.503 ±0.025 0.671 ±0.051 6.725 ＜0.01 t 值C-IBS 组0.186 9.309 P 值＞0.05 ＜0.01

图1 各组升、降结肠AQP9 mRNA 表达及GAPDH mRNA 表达 A:AQP9 mRNA;B:GAPDHFig 1 Expressions of AQP9 mRNA and GAPDH mRNA in ascending and descending colon of each group A:AQP9 mRNA;B:GAPDH

3 讨论

IBS 是一种以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变为特征的功能性肠病，是一种有特殊病理生理基础的肠功能紊乱性疾病，其特征是肠壁无器质性病变。随着近年来人们生活节奏的加快、饮食结构的改变，IBS 发病率有上升趋势，国内有一项大型流行病学调查结果显示，我国城市的IBS 患病率约为10.5%。IBS 患者就诊率高，占消化内科门诊患者总数的10% ～22%，尽管它不是一种短时间内危及患者生命的疾病，但对患者的生活质量和工作造成一定的困扰，并消耗大量的医疗资源。目前确切病因及发病机制尚不十分清楚，是当前乃至今后的研究热点及难点。患者腹泻及便秘症状的出现与结肠分泌和吸收功能障碍密切相关，可能是其重要致病因素之一。

AQPs 是选择性转运水分子的一族特异孔道，广泛存在于原核和真核生物膜上，控制水分子在生物膜之间快速被动转运。目前在哺乳动物中已发现了13 种AQPs(即AQP 0 ～12)。AQP9 是水通道蛋白家族的成员之一，其在食管、胃、小肠、结肠、肝脏均有表达;其中在肝脏的研究比较多，且已证实AQP9 与脂肪肝［2-3，5-6］、肝癌［7-8］、肝外胆汁淤积［9］密切相关。AQP9在结肠主要表达于杯状细胞的基底侧［10］，其表达量受渗透压的调节［11-12］。已有研究［1］通过蛋白质印迹技术发现降结肠表达量比升结肠多，且便秘患者升结肠AQP9 表达无明显变化，而降结肠表达量明显降低，提示降结肠AQP9 表达减少，黏液分泌减少，大便含水量减少、干结，出现排便困难症状。我们的研究发现，正常人升、降结肠黏膜组织均有AQP9 表达，且降结肠表达高于升结肠;C-IBS 组升、降结肠黏膜组织中AQP9 mRNA 表达量均较正常对照组低，但降结肠降低更为显著，而升结肠降低不明显，提示C-IBS 出现便秘症状与降结肠AQP9 表达下调黏液分泌减少、大便含水量减少有关，出现大便干结、排便困难。总之，进一步研究肠道AQP9 与肠道水代谢异常疾病的关系及其调节机制，不仅能为某些疾病状态提供理论上的解释，而且可为临床相关疾病的治疗提供新的思路和方法。

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