针刺配合芹菜素治疗对胶原诱导性关节炎小鼠Th1/Th2细胞亚群的影响

针刺配合芹菜素治疗对胶原诱导性关节炎小鼠Th1/Th2细胞亚群的影响

张洁刘巍1朱新辉1周鸣鸣朱小波2

(南通大学医学院，江苏南通226019)

摘要〔〕目的观察针刺配合芹菜素对胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠的疗效和外周血中Th细胞亚群分布，探讨针刺配合芹菜素对类风湿关节炎(RA)的疗效及其机制。方法在初次免疫后第4周开始对CIA小鼠连续针刺治疗3 w，观察其关节炎指数，应用ELISA技术对CIA组小鼠和对照组小鼠脾淋巴细胞中辅助T细胞(Th)亚群分布进行检测。结果治疗后与模型组相比，针刺组、芹菜素组及针刺加芹菜素组小鼠的关节炎指数下降(P<0.05)，针刺加芹菜素组下降更明显(P<0.01)。针刺和芹菜素均能抑制CIA小鼠Th1细胞分泌，降低Th1/Th2 比值，对Th2 细胞的分泌无明显影响。结论针刺配合芹菜素治疗CIA小鼠疗效明显优于单独针刺或芹菜素治疗CIA小鼠的关节炎，可能是通过调节Th1/Th2，抑制Th1分化格局使之接近动态平衡而起作用的。

关键词〔〕针刺；芹菜素；类风湿关节炎；辅助T细胞

中图分类号〔〕R965.3〔文献标识码〕A〔

基金项目：南通市社会发展科技计划资助项目(S2012042，HS13921)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

通讯作者：周鸣鸣(1977-)，男，博士，副教授，主要从事中医学研究。

1南通大学附属第二医院关节外科2如皋市人民医院儿科

第一作者：张洁(1980-)，男，博士，主要从事免疫学研究。

1材料与方法

1.1动物SPF级雄性DBA/1小鼠，8～12周龄，体重20～25 g，由南通大学实验动物中心提供。所有小鼠均在室温22℃相同条件下分笼饲养，用标准颗粒饲料自由喂养，自由饮水。

1.2药品与试剂牛Ⅱ型胶原、弗氏完全佐剂(CFA)和不完全佐剂(IFA，Chondrex公司)，小鼠干扰素(IFN)-γ和白介素(IL)-4的ELISA试剂盒(依科赛公司)，AP(美国Sigma公司，A3145)；二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司)。

1.3主要仪器台式高速低温离心机(XL100型，美国Beckman公司)、电热恒温培养箱(Heraeus，德国)、针灸针(华佗牌)、微量进样器(上海安亭微量进样器厂)和UV-3100PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。

1.4方法

1.4.1小鼠胶原性关节炎模型的建立Ⅱ型胶原100 μg溶于0.05 mol/ml醋酸50 μl中，浓度为2 mg/ml，将溶解的胶原与CFA等体积混合，冰浴中使用三通充分乳化。免疫动物时，在小鼠尾根部多点皮下注射0.1 ml乳剂。基础免疫后第21天以同样方法重复，避开初次免疫部位，进行加强免疫。再次免疫佐剂选择用IFA。同时对照组用CFA与0.05 mol/ml冰醋酸等体积充分乳化后按上述方法进行免疫及IFA与0.05 mol/ml冰醋酸等体积乳化后21 d加强免疫。

1.4.2动物分组与处理50只小鼠分成5组(n=10):即针刺组、AP组、针刺+AP组,模型组和对照组。针刺组小鼠以自制布袋固定，选取双侧足三里(后三里)穴(膝关节下外侧，腓骨小头下3.5 mm处)，直刺3 mm，每天1次，连续3 w，共21次；AP组(AP溶于1% DMSO),CIA小鼠出现症状后(21 d)分别给予腹腔注射AP 10 mg·kg-1·d-1；针刺加AP组同时给予注射AP 10 mg·kg-1·d-1和双侧足三里(后三里)穴位刺激，连续3 w；对照组给予腹腔注射1% DMSO，连续3 w。

③河（沟）道水文地貌状况改善效果。河道水文形态特征的修复是本项目的重点，也取得了显著的成效。经调查和统计，6条小流域主沟道工程前后水文地貌特征有了整体改善，Ⅲ级、Ⅳ级沟段长度明显减少，Ⅱ级沟段长度增加。2.53km的Ⅳ级沟段修复为Ⅲ级或Ⅱ级，使得Ⅳ级沟段长度比例由工程前的14.76%降为工程后的10.10%；3.73km的Ⅲ级沟段修复为Ⅱ级或Ⅰ级，使得Ⅲ级长度比例由工程前的31.51%降为24.69%；项目区Ⅱ级沟段长度明显增加，增加总长为6.25km，所占比例由34.35%升至45.84%。同时，6条流域沟道的垃圾全部清理，挖砂采石段全部修复，对沟道生态质量和水质改善发挥了显著作用。

1.4.3小鼠关节炎评分各关节病变程度按5级评分法。0：无红肿；1：关节红不肿；2：关节轻度红肿；3：关节中度红肿；4：关节重度红肿伴功能障碍。关节炎分数为每只小鼠所有病变关节分数的总和，最高分为16分。

1.4.4血清的IFN-γ和IL-4检测免疫4 w后，对所有实验小鼠采用摘眼球法取血，0.5 ml/只，置于37℃水浴箱中1 h，然后置4℃冰箱中以析出血清，4 000 r/min离心10 min，吸取血清，贮于-80℃冰箱保存。ELISA试剂盒检测IFN-γ和IL-4。

1.4.5大体指标观察观察小鼠的精神状态，毛发的光泽亮度，毛发的疏密,实验小鼠的体重和其他性状。

1.5统计学方法应用SPSS15.0软件进行t检验。

2结果

2.1针刺和AP影响CIA小鼠的大体观察牛Ⅱ型胶原免疫的模型组小鼠，与对照组小鼠比较，初次免疫后3 w左右开始出现关节炎症状，即鼠爪明显红、肿，关节炎指数均明显增加。21 d开始后足出现关节肿胀，然后蔓延到前足，并日渐加重，在45 d左右达高峰。另外，在发病过程中，动物的毛色失去光泽、轻微脱毛，体重减轻。而针刺和AP组发病推迟出现症状，整个病程足爪肿胀程度减小。毛色失去光泽、轻微脱毛，体重减轻这些症状也有一定的减轻。

2.2针刺和AP对于CIA小鼠关节炎症状的影响根据关节病变程度按5级评分法，与对照组小鼠比较，模型组小鼠21 d开始后足出现关节肿胀，并日渐加重，在45 d左右达高峰。针刺组、AP组和针刺+AP组的关节炎指数也轻于模型组(P<0.05)，提示针刺配合AP可以更好地改善RA临床症状，保护关节，且疗效优于单纯针刺或AP治疗。见图1。

图1　针刺和AP对CIA小鼠关节评分的影响(n=10)

2.3针刺和AP对小鼠血清IFN-γ、IL-4水平的影响IL-4水平在针刺+AP组与模型组相比升高明显(P=0.03)，针刺组和AP组与模型组相比升高不明显；IFN-γ水平在针刺+AP组和AP组均较模型组有显著下降，只有针刺组与模型组相比下降不明显。模型组IFN-γ/IL-4比对照组明显升高(P=0.002)，而治疗组与模型组相比均显著下降，其中针刺+AP组下降最多(P=0.006)。见表1。

组别IFN-γ(pg/ml)IL-4(pg/ml)IFN-γ/IL-4模型组316.29±19.49135.41±4.072.34±0.11AP组284.77±5.312)142.73±4.212.00±0.101)针刺组303.81±3.64139.85±9.202.17±0.191)针刺+AP组248.33±8.602)143.69±9.831)1.73±0.182)对照组190.11±9.342)163.67±5.211.16±0.062)

与模型组比较：1)P<0.05；2)P<0.01

3讨论

辅助性T细胞Th1与Th2细胞之间的动态平衡对维持机体正常的免疫功能起重要作用，Th1细胞功能亢进可促进某些器官特异性自身免疫病的发展〔4〕。近年研究提示RA发病与Th1细胞介导的自身免疫应答异常有关。Th1主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12和TNF-α，以IFN-γ为代表；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，以IL-4为代表。RA患者关节滑膜、滑膜液和外周血中存在Th1/Th2亚群失衡。Kanik等〔5〕观察到，同慢性患者相比，早期RA的外周血中，IL-2和IFN-γ明显增多，随着关节炎的发展，Th1细胞逐渐减少，Th2细胞占优势，这可能与Th1细胞选择性地聚集到关节炎症部位有关。

CIA小鼠作为类似RA的动物模型,表现为多发性外周关节炎,关节局部红肿,严重致关节畸形。病理变化为增生性滑膜炎,关节软骨破坏、骨侵蚀,关节腔内有炎性细胞浸润,这些病理表现及实验室指标与人RA非常相似。另外，CIA小鼠的关节炎程度还可以通过指数量化评分评估这些特点决定CIA小鼠是筛选和研究治疗RA药物的较理想动物模型〔6〕。

祖国医学常利用多种手段联合治疗疾病，针灸配合中药往往能起到“事半功倍”的效果。针灸对RA有较好的疗效，一般有效率可达85%～95%，尤其是早期RA患者〔7〕。周建霞等〔8〕用闪刺重灸法，先用毫针于阿是穴快速进针，疾进疾出，取双足三里，百会予以补法，风池、丰隆予以泻法，合谷、曲池、大椎予以平补平泻法；后于闪刺点以温和灸法总有效率93.8%。周燕媛〔9〕针刺治疗15例，取主穴肝俞、膈俞、夹脊穴、肾俞血海、足三里；配穴合谷，委中，阿是穴，丰隆阳，陵泉，曲池，风池等；以电针连接阿是穴，夹脊，环跳，阳陵泉，悬钟，足三里等穴；采用《最新国内外疾病诊疗标准》评价其疗效，结果总有效率93.3%。结合上述研究的成果，选取了与RA发病位置较靠近的穴位(足三里)作为靶穴位。AP是存在于各种水果及蔬菜中的常见的黄酮类化合物，现有研究表明AP具有抗炎、抗氧化和抗癌等作用〔10～12〕。研究表明AP具有免疫抑制作用，能抑制T细胞过度增殖、活化，抑制Th1型细胞功能亢进及调节Th1/Th2平衡。此外，中药单体AP来源广泛，有安全、不良反应小等特点，治疗RA具有潜在的临床应用前景。基于以上原因，实验中选取了AP配合针刺来治疗CIA小鼠的关节炎病症。

本研究发现，针药配合使用对于CIA小鼠模型的关节炎症有更好的治疗效果，针刺(双足三里)和AP均能抑制Th1细胞占优势的格局，调节CIA小鼠的Th1/Th2平衡，阻止RA发生炎症反应。

4参考文献

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8周建霞,周建平,陈善龙.闪刺重灸法治疗类风湿性关节炎32例〔J〕.针刺研究,1997；22(3):217-8.

9周燕媛.针刺治疗强直性脊柱炎15例〔J〕.中国针灸,1999；15(3):166.

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〔2013-12-19修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)