三叶青水提物对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症的抑制作用

三叶青水提物对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症的抑制作用

王小莉 吕江明

(吉首大学医学院，湖南吉首416000)

摘要〔〕目的探讨三叶青水提物对慢性阻塞性肺疾病(COPD)实验性大鼠炎症的影响。方法选择烟熏加气管内注射脂多糖(LPS)法复制COPD模型，将健康SD雄性大鼠60只，随机分为5组：正常对照组，COPD模型组和三叶青低剂量、中剂量、高剂量组(分别为0.5、1.0、2.0 g/kg)，每组12只。造模成功后肺组织HE染色观察气道病理改变，测定血清和肺组织中C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-6的水平，取支气管肺泡灌洗液(BALF)测定炎症细胞数和白细胞比率。结果三叶青各剂量组CRP、IL-6水平及炎症细胞总数及白细胞比例较模型组明显减少(P<0.05)，高、中、低剂量组炎症细胞总数和中性粒细胞比例显著下降，并呈一定的剂量效应关系(P<0.05)。与正常对照组比较，模型组和各治疗组中CRP、IL-6水平及炎症细胞总数和中性粒细胞比例显著升高(P<0.05)。结论三叶青水提物能够抑制COPD大鼠的炎症反应。

关键词〔〕三叶青水提物；白细胞介素(IL)-6；C-反应蛋白；慢性阻塞性肺疾病

中图分类号〔〕R361〔文献标识码〕A〔

基金项目：湖南省科技计划项目(No.2014SK3010)

三叶青属于葡萄科属植物，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功效，临床用来治疗小儿惊厥高热、肺炎、支气管炎、咽喉炎、痢疾、肝炎、病毒性脑膜炎、肿瘤等症〔1〕。三叶青对于炎症的研究较少。本研究用三叶青水提物对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型进行干预，通过观察大鼠肺组织病理改变，检测血清及肺组织中C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素6(IL-6)的水平，检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞及分类，探讨三叶青对炎症的影响及其机制。

1材料和方法

1.1实验动物健康SD雄性大鼠购买于湖南长沙市开福区东创实验动物科技服务部，动物编号HNACSDC20120292，体重(272±28)g，鼠龄12 w。

1.2分组将60只大鼠随机分为5组：正常对照组、模型组和三叶青低、中、高剂量组，每组12只。

1.3三叶青水提物的提取三叶青由吕江明老师在湖南吉首市郊采集，由我院中药学李春艳教授鉴定。将三叶青全株500 g干燥、粉碎，过筛，水煎3次，每次30 min，合并水煎液，浓缩为1 g/ml(生药)，得到三叶青水提物。

1.4COPD模型制作采用2次气管内注入LPS(LPS)和反复烟熏的方法制作COPD大鼠模型〔2〕。第1、14天各向气管内缓慢注入脂多糖200 μg (200 μl)，将大鼠放入的有机玻璃制成的烟熏箱内，在其右上角开通1个直径1 cm的通气孔，将点燃的香烟(长沙卷烟厂白沙牌香烟)通过三通将烟雾吸入100 ml的注射器中，关闭吸烟通路一端，再打开三通的另一端将烟雾注入烟熏箱内进行大鼠被动吸烟，每天吸烟2次，每次16支，时间30 min，2次间隔4 h，连续28 d。吸烟8 d后每天吸烟前通过灌胃器给大鼠灌三叶青水提物(低剂量组、中剂量组、高剂量组为0.5、1.0、2.0 g/kg，加生理盐水至2 ml)，共28 d。正常对照组灌入等容量的生理盐水，28 d后处死大鼠用于实验观察。

1.5肺组织病理学标本制作各组于实验结束后次日取每只大鼠右中叶肺组织，用4%甲醛固定24 h后石蜡包埋制成切片，HE染色光学显微镜下观察。

1.6匀浆肺组织取500 mg肺组织，加入生理盐水1.0 ml，组织匀浆器充分研磨，5 000 r/min离心10 min，取上清0.1 ml，加生理盐水至1.0 ml，充分混匀，5 000 r/min离心10 min，取上清液待测。

1.7血清采集从大鼠心脏取血约5 ml,3 500 r/min，离心半径20 cm,10 min，取血清-20℃保存。

机械电气一体技术在应用的过程中，由于其具有数字显示、程序控制功能，无需设计过多的手柄、按钮，其操作相对比较方便。同时，鉴于该技术具有重复动作的功能，可以自动选择程序，减少了操作人员的工作量。

1.8BALF的采集将大鼠右主支气管结扎，用套管针穿刺至左肺，缓慢注入无菌生理盐水3 ml，重复3次，每次注入后立即回吸，灌洗液纱布过滤，回收率大于80%，得到BALF合格标本。用于白细胞总数计数和细胞分类计数。

1.9CRP、IL-6水平的测定利用H6000-020全自动生化分析仪，严格按照说明书进行检测，大鼠CRP试剂盒、IL-6试剂盒购买于湖北武汉博士德生物有限公司。

1.10统计学方法采用SPSS13.0软件进行t检验。

2结果

2.1各组大鼠病理改变正常对照组大鼠支气管黏膜纤毛柱状上皮排列整齐，气道、管壁及周围炎症细胞浸润；模型组的大鼠支气管黏膜上皮变性、脱落，管壁伴有淋巴细胞浸润，肺泡囊和肺泡扩张明显，肺泡壁变薄伴有不同程度的断裂，形成肺大疱。三叶青低剂量、中剂量及高剂量组大鼠黏膜上皮改变、炎性细胞浸润以及肺泡腔扩大、肺泡壁断裂情况较模型组有不同程度的减轻，较正常对照组重。见图1。

模型组

对照组

三叶青低剂量组

三叶青中剂量组

三叶青高剂量组

图1各组大鼠病理改变(HE，×100)

2.2实验大鼠血清及肺组织匀浆中CRP、IL-6的测定与正常对照组比较，模型组血清及肺组织中的CRP、IL-6明显增多(P<0.01)。与模型组比较，三叶青高、中、低剂量组血清及肺组织中的CRP、IL-6均减少(P<0.05)。三叶青低、中剂量组间血清及肺组织中的CRP、IL-6水平无明显差异(P>0.05)，三叶青高剂量组与低剂量组差异显著(P<0.05)。见表1。

2.3支气管肺泡灌洗液中细胞计数及分类与正常对照组比较，模型组中BALF炎症细胞总数和白细胞比例增加，差异有统计学意义(P<0.01)。高、中、低各剂量治疗组炎症细胞总数和白细胞比例较模型组减少，并呈一定的剂量效应关系，差异具有统计学意义(P<0.05)，治疗组中性粒细胞计数高于正常对照组(P<0.05)。见表1。

组别 CRP(μg/ml) IL-6(pg/ml) 血清肺组织血清肺组织白细胞总数(×108/L)中性粒细胞(%)单核细胞(%)淋巴细胞(%)正常对照组0.4327±0.0230.6378±0.02317.98±2.1240.23±0.131.78±0.813.48±0.5384.38±8.1312.91±6.89COPD模型组1.238±0.0171)1.6380±0.0251)60.23±3.181)101.22±0.231)5.88±0.491)21.98±4.991)70.03±6.127.86±3.28低剂量治疗组0.9253±0.0122)0.9025±0.0322)40.82±2.092)70.94±0.152)4.28±0.452)15.28±3.152)77.27±5.137.23±2.28中剂量治疗组0.8438±0.0342)0.8256±0.0202)34.28±3.322)55.83±0.222)3.23±0.231)2)14.38±2.781)2)79.29±4.896.53±1.98高剂量治疗组0.5500±0.0182)3)0.4416±0.0062)3)30.89±2.142)3)50.78±0.142)3)2.13±0.382)3)10.23±2.082)3)80.23±4.326.98±3.21

与正常对照组比较：1)P<0.01，与模型组比较：2)P<0.05，与三叶青低剂量组比较：3)P<0.05

3讨论

吸烟可刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞产生前炎症因子、趋化因子及细胞因子，如TNF、细胞间黏附分子(ICAM-1)、IL-6、IL-8等，导致白细胞黏附、移行到炎症部位参与炎症反应〔3〕。LPS为革兰阴性菌的外层结构可直接造成气道上皮损伤,又可激活巨噬细胞、淋巴细胞,生成前致炎因子肿瘤坏死因子(TNF)、IL-1、IL-6等,趋化并激活中性粒细胞,释放蛋白酶等细胞毒性物质,导致支气管慢性炎症及肺气肿形成〔2〕。本实验通过熏烟加气管内注射LPS法建立COPD大鼠模型，光学显微镜下观察到COPD模型组大鼠肺泡壁、支气管壁、肺泡间隔可见大量炎症细胞浸润，黏膜下层、肌层、血管周围大量炎症细胞浸润，肺泡壁变薄断裂，肺泡结构不完整，肺大疱形成，符合COPD病理改变。采用两次气管内注入适量LPS和反复熏烟的方法,可成功地复制出大鼠COPD 模型。本研究结果说明三叶青可以减轻COPD肺组织炎症病理改变，对COPD炎症有一定的防治作用。

近年研究表明，COPD气道炎症是以淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞浸润为主，这些被激活的炎症细胞可释放许多炎性介质及细胞因子，参与气道炎症的进展，而IL-6、IL-8是参与COPD气道炎症的重要细胞因子〔4,5〕。本实验结果说明COPD气道及肺组织中的炎症细胞以中性粒细胞和巨噬细胞为主，与曹丽华等〔6〕研究结果相符。本研究结果提示IL-6参与了COPD的炎症反应，是介导COPD炎症重要的细胞因子，三叶青提取物可以降低IL-6的含量，对炎症有一定的抑制作用。

CRP是一种对多种刺激因素包括感染、组织损伤、坏死都能迅速发生反应的蛋白，常可作为一种反应炎症、组织损伤程度以及评价治疗反应的非特异性敏感指标〔7〕。本实验说明CRP在COPD具有较高的表达，CRP参与了COPD的炎症反应，是反映病情的重要生物学标志。三叶青通过减低CRP的表达对大鼠COPD的炎症有一定的抑制作用，并且呈现出一定的浓度依赖性。

4参考文献

1江苏新医学院.中药大辞典〔M〕. 下册. 上海:上海人民出版社，1977:2133.

2宋一平,崔德健,茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及药物干预的影响〔J〕.中华内科杂志,2000;39(8):712-4.

3施焕中.慢性阻塞性肺疾病〔M〕.北京：人民卫生出版社，2006:95-100.

4胡蓉.COPD患者治疗前后血清hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-8检测的临床意义〔J〕.放射免疫学杂志,2007;20(6):503.

5刘景艳,修清玉.细胞因子在慢性阻塞性肺疾病发病中的作用〔J〕.国外医学·呼吸系统分册,2005;25(6):420-2.

6曹丽华，康健，王洋，等. 标准桃金娘油对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症的影响〔J〕.大连医科大学学报，2010;32(1)：18-22.

7Germani A，Limana F，Capogrossi MC. Pivotal advances :high-mobility group box 1 protein-a cytokine with a role in cardiac repair〔J〕. J Leukoc Biol，2007;81(1):41-5.

〔2013-12-07修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)