窑归多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用

窑归多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用

王振富钟灵1杨付明

(湖北民族学院医学院，湖北恩施445000)

摘要〔〕目的探讨窑归多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用及其机制。方法复制四氯化碳(CCl4)急性肝损伤小鼠模型，将昆明种小鼠50只随机分为5组(n=10)，即正常对照组、模型组、联苯双酯组、窑归多糖低剂量组和高剂量组。窑归多糖低剂量组和高剂量组行窑归多糖灌胃21 d，除正常对照组，其余各组腹腔注射CCl4，24 h后测定小鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(AST) 、谷丙转氨酶(ALT)及肝脏指数，测定肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。测定小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2、IL-10的含量。结果与正常对照组比较，模型组小鼠LDH、AST、ALT 及肝脏指数明显升高，SOD和GSH-Px的活性降低，MDA含量明显增加，TNF-α和 IL-2明显升高、IL-10明显降低(P<0.01)；与模型组比较，窑归多糖低剂量组和高剂量组小鼠LDH、AST、ALT及肝脏指数明显降低，SOD和GSH-Px的活性增强，MDA含量明显减少，TNF-α和 IL-2明显降低、IL-10明显升高(P<0.05，P<0.01)。结论窑归多糖对小鼠急性肝损伤有明显的保护作用。

关键词〔〕窑归多糖；四氯化碳；肝损伤；炎性因子；抗氧化酶

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家中医药管理局公共卫生专项资金项目(财社[2010]91号)

1湖北民族学院附属民大医院

第一作者：王振富(1965-)，男，副教授，主要从事中药药理学研究。

当归是伞形科植物当归Angelica sinensis(oliv.)Diels的干燥根，具有多种药理学效应，如补血活血、调经止痛、润肠通便、生肌腱骨之功效；用于血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、经闭痛经、虚寒腹痛、肠燥便秘、风湿痹痛、跌扑损伤等〔1〕。当归对人体呼吸、循环、血液及免疫系统均有作用，此外还有抗肿瘤作用，其主要活性成分为多糖、阿魏酸、挥发油、黄酮类等。窑归是恩施石窑产当归的习称，其质量优良，为南方常用当归品种。多糖是一类存在于百余种植物中，具有广泛生物活性的大分子物质，其生理活性强，细胞毒性低，毒副作用小，因此对植物多糖的研究已成为热点。有研究表明，归芪多糖具有一定的抗氧化、抗病毒、延缓衰老和保护肝损伤的作用〔2，3〕。本研究以四氯化碳(CCl4)诱导急性肝损伤小鼠模型实验，观察窑归多糖在保护肝损伤方面的作用。

1材料与方法

1.1主要试剂和药品CCl4(天津市四通化工厂)，联苯双酯滴丸(浙江万邦药业有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(华美生工)； 肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2和IL-10试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)。

1.2主要仪器全自动生化分析仪(日本Olympus Au400)，双目显微镜(日本Olympus ABX41)，756型紫外分光光度计(上海分析仪器总厂),BE-5286A型旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司)，ULTRA-TURRAX378型组织匀浆机(东莞市通用精工液压机械工具厂)，MK3型酶标仪(成都一科仪器设备有限公司) 。

1.3动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～25 g(由湖北省实验动物中心提供)。

1.4实验方法

1.4.1窑归多糖提取〔4〕窑归(湖北恩施石窑)，干燥，粉碎过筛，取当归粉末25 g，石油醚回流提取1.5 h，滤过，弃去滤液，滤渣用80%乙醇回流提取1.5 h，滤过，弃去滤液，滤渣用蒸馏水提取3次，每次1.5 h，合并3次滤液，滤液浓缩至100 ml，加95%乙醇使含醇量达80%，低温(4℃左右)放置24 h，即析出粗多糖。用Sevage法对粗多糖进行脱蛋白，直至260 nm和280 nm处无明显吸光为止，收集上清液，用0.2%活性碳脱色2次，干燥，得窑归多糖，称重。

1.4.2动物分组、处理及模型的建立〔5〕将昆明种小鼠50只随机分为5组(n=10)，即正常对照组、模型组、联苯双酯组、窑归多糖低剂量组和高剂量组。窑归多糖低剂量组和高剂量组分别以100、200 mg/kg；联苯双酯组以200 mg/kg，正常对照组和模型组以等量生理盐水灌胃。照常饮水喂食，持续21 d，于第21天给药1 h后，除正常对照组腹腔注射等量生理盐水外，其余各组腹腔注射0.08%(用花生油配制)CCl4(0.1 ml/10 g)。18 h后摘眼球取血，分离血清待测。摘取肝脏，生理盐水漂洗，滤纸拭干后称重，按1∶9加入预冷的生理盐水，匀浆(4℃，2 500 r/min 30 min)，上清即为10%肝组织均浆液，-40℃保存待测。

1.4.3测定指标和方法用全自动生化分析仪(Olympus Au400)测LDH、AST、ALT；用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测TNF-α、IL-2和IL-10；以邻苯三酚法测SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸法测定GSH-Px，硫代巴比妥酸显色法(TBA)测MDA含量。

1.5统计学方法采用SPSS15.0软件进行t检验。

2结果

2.1窑归多糖对小鼠LDH、ALT、AST及肝脏指数的影响与正常对照组比较，模型组小鼠LDH、ALT、AST及肝脏指数显著升高(P<0.01)；与模型组比较，联苯双酯组、窑归多糖低剂量组和高剂量组小鼠LDH、ALT、AST及肝脏指数明显降低(P<0.01)，见表1。

2.2窑归多糖对小鼠SOD、GSH-Px及MDA的影响与正常对照组比较，模型组小鼠SOD和GSH-Px活性明显降低，MDA含量明显增高(P<0.01)，与模型组比较，联苯双酯组、窑归多糖低剂量组和高剂量组小鼠SOD和GSH-Px活性明显升高，MDA含量明显降低(P<0.05，P<0.01)，见表2。

2.3窑归多糖对小鼠TNF-α、IL-2及IL-10的影响与正常对照组比较，模型组小鼠TNF-α和IL-2的含量明显升高，而IL-10的含量明显减少(P<0.01)；与模型组比较，联苯双酯组、窑归多糖低剂量组和高剂量组小鼠TNF-α和IL-2的含量明显减少，而IL-10的含量明显升高(P<0.01)，见表2。

组别LDH(U/L)ALT(U/L)AST(U/L)肝脏指数(mg/g)正常对照组112.32±13.8122.40±3.6740.31±19.3546.30±1.45模型组2132.83±71.481)114.22±17.201)183.45±23.361)54.13±1.651)窑归多糖低剂量组369.67±12.312)63.93±8.472)88.45±8.932)50.27±2.472)窑归多糖高剂量组316.72±13.262)43.34±4.402)64.35±7.192)49.53±1.862)联苯双酯组328.59±12.252)31.321±4.362)49.32±4.402)47.40±1.682)

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01

组别MAD(nmol/ml)SOD(U/L)GSH-Px(U/L)TNF-α(mg/L)IL-2(mg/L)IL-10(mg/L)正常对照组12.48±1.35459.45±43.1098.32±18.3629.91±1.2616.78±0.5663.37±1.53模型组25.55±2.901)325.75±22.931)46.38±19.261)49.68±0.601)49.60±0.621)56.53±1.171)窑归多糖低剂量组21.78±2.002)370.20±24.712)79.67±15.102)42.10±1.363)42.03±1.373)67.14±2.473)窑归多糖高剂量17.54±1.303)413.80±28.833)86.45±14.603)41.78±3.103)40.31±0.803)72.02±3.303)联苯双酯组15.50±1.483)434.65±32.503)92.56±18.773)39.64±2.313)42.25±1.493)71.21±1.463)

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01

3讨论

各种有害因素导致的肝脏损伤，其表现为脂肪肝、胆汁淤积、肝细胞纤维化、肝细胞坏死、肝硬化及肝癌等。目前，对肝损伤的防治仍然是一大难题。CCl4引起肝损伤，在形态及病理生理方面与人的慢性肝病较为相似〔6，7〕。研究表明，楤木叶总皂苷保护肝损伤作用机制是通过肝细胞内酶系统的诱导作用，从而使肝细胞的核酸、蛋白质、糖原的合成及能量的合成增加，保护肝细胞膜的正常结构而起到保护肝损伤的作用〔7〕。有报道枸杞多糖、黄芪多糖等对CCl4引起的肝损伤有保护作用〔8，9〕。本实验结果说明机体抗氧化酶活性降低，清除自由基的能力下降，过氧化脂质的代谢产物MDA堆积，进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性的脂褐质，沉积于组织细胞，破坏细胞膜结构，导致细胞内的转氨酶(如AST、ALT)等释放入血液，最终导致细胞无法维持正常代谢而死亡〔10〕。窑归多糖能明显改善上述指标，表明窑归多糖一方面可通过提高机体抗氧化酶的活性，或直接清除机体过多的自由基而发挥其保护肝的作用。CCl4引起小鼠TNF-α和 IL-2明显升高、IL-10明显降低，说明炎性因子(TNF-α、IL-2)的产生和释放，抑炎因子(IL-10)降低引起了明显炎症反应。窑归多糖能明显改善上述指标，表明窑归多糖另一方面可通过下调炎性因子和上调抑炎因子而达到保护肝的作用，但其确切机制还需进一步研究。

4参考文献

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3Pu XY,Li Y,Zhou LY.Deferring senile effect of polysaccharides from Angelica and Astragalus on aging mice〔J〕.Int Confer Hum Health Biomed Engineer,2011；2(2):289-92.

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〔2013-12-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)