湖南省猪源粪肠球菌耐药性分析

王送林，李芸芳，刘秋菊，朱 娜，蒋 伟，邓治邦，黎满香

（湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）

·研究论文·

湖南省猪源粪肠球菌耐药性分析

王送林，李芸芳，刘秋菊，朱 娜，蒋 伟，邓治邦，黎满香

（湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）

为了解湖南省猪源粪肠球菌临床分离株的耐药性及各耐药基因的分布情况，使用K-B法检测了42株猪源粪肠球菌对11种抗生素的敏感性，采用PCR方法检测了粪肠球菌中8种耐药基因的分布情况。结果显示，湖南省临床分离的42株粪肠球菌对大部分的抗生素高度耐药，对四环素、氯霉素、苯唑青霉素、红霉素、米诺霉素、左氧氟沙星、高浓度庆大霉、高浓度链霉素、环丙沙星、万古霉素、青霉素G的耐药率依次为100%、92.9%、88.1%、83.3%、81%、57.1%、52.4%、47.6%、45.2%、31%、11.9%；耐药基因的检出率为Aac（6）'/aph（2''）97.6%、ant（6）'-Ⅰ 90%、aph（3）'-Ⅲ76.2%、tetM90.5%、ermB 73.8%、VanA 4.8%、VanB 54.8%、VanC 88.1%。从表型与基因型共同分析粪肠球菌的耐药性，发现粪肠球菌的多耐药性严重，其耐药表型与耐药基因并不完全一致。

粪肠球菌；耐药性；耐药基因

粪肠球菌是人和动物肠道内的正常菌群之一，也是一种条件致病菌，能引起脑膜炎、尿路感染、败血症、腹腔感染等多种感染[1]。近年来不断有动物感染粪肠球菌的报道[2]，粪肠球菌在兽医临床的分离率不断增多。抗菌药物的大量使用，使粪肠球菌进化出许多针对抗生素的机制，并产生了对应的耐药基因，同时这些耐药基因还能通过转座子系统、基因盒-整合子系统、基因插入、质粒、细菌染色体交换等方式，从一种细菌转移到另一种细菌，或者从这一株细菌转移到其他同种的细菌，使临床治疗粪肠球菌感染成为一大难题。为了解临床分离粪肠球菌的耐药情况，为临床治疗提供根据，本文对湖南省临床分离的42株粪肠球菌的药敏情况及耐药基因进行了分析研究。

1 材料与方法

1.1 菌株试验菌株包括从湖南省各地送检病猪脑、脾脏、肺脏、关节等组织分离的42株粪肠球菌[3]以及粪肠球菌标准菌株ATCC29212。

1.2 仪器与试剂ZHJH-1214B型净化工作台购自上海智城分析仪器制造有限公司；ABI 2720型PCR扩增仪及成像系统购自美国ABI公司；AYJI-1002-U型超纯水仪购自台湾艾科浦；DYY-6C型电泳仪及DYPZ-24E型电泳槽购自北京六一仪器厂； YXQLS-18SI型自动高压灭菌器购自上海博迅实业有限公司；药敏纸片及标准菌株皆购自杭州天和微生物试剂有限公司；Taq DNA聚合酶和dNTP购自天根生物工程公司。

1.3 药敏试验在净化工作台内取吸光度已调节至0.08～0.1范围内的稀释菌液100 μL均匀、全面地涂布于TSA平板上后，将平板置于净化工作台内10～15 min直至表面液体被培养基吸收，然后将药敏纸片根据预实验确定的最大抑菌圈的大小轻轻一次性贴于平板表面，37℃静置培养18～24 h后测量结果（据NCCLS参考方案，由于万古霉素作用时间缓慢，应当静置培养24h以上才能观察结果）。药敏纸片包括：四环素（30 μg/片）、红霉素（15 μg/片）、万古霉素（30 μg/片）、米诺霉素（30 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、苯唑青霉素、青霉素G (10万单位)、环丙沙星（5 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、高浓度庆大霉素（120 μg/片）、高浓度链霉素（300 μg/片）。

1.4 PCR扩增耐药基因

1.4.1 扩增引物 扩增所用引物[4]见表1，由上海生物工程有限公司合成。

表1 耐药基因扩增引物Table1 The primers used to amplify resistance genes

1.4.2 PCR扩增耐药基因 PCR扩增体系如下：10×Buffer缓冲液2 μL、dNTP混合物1 μL、上下游引物各0.2 μL、Taq DNA聚合酶0.5 μL、模板1 μL、加灭菌ddH2O将体系调至20 μL。扩增程序如下：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，各耐药基因按表1中的温度退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min。取扩增产物在1 g/mL的琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统拍照进行结果对比分析，产生预计扩增大小的条带为阳性，无预计大小条带的为阴性结果。

2 结果

2.1 药敏试验结果湖南省临床分离的42株粪肠球菌均呈现为多重耐药，所有的菌株都对3种或3种以上的抗生素耐药，有3株粪肠球菌对11种抗生素全部耐药。所有的粪肠球菌对四环素全部耐药；对其他几种抗生素的耐药性由高到低依次为氯霉素（92.9%）、苯唑青霉素（88.1%）、红霉素（83.3%）、米诺霉素（81.0%）、左氧氟沙星（57.1%）、高浓度庆大霉素（52.4%）、高浓度链霉素（47.6%）、环丙沙星（45.2%）、万古霉素（31.0%）、青霉素G（11.9%）。粪肠球菌对青霉素最为敏感，敏感率为（88.1%）。结果详见表2。

2.2 耐药基因扩增结果PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析，湖南省临床分离的42株粪肠球菌中除VanA的检出率为4.8%（2/42），其他耐药基因的检出率都相当高，均在50%以上，Aac（6）'/aph （2''）的检出率更是高达97.6%（41/42）。见表3。aph(3)'-Ⅲ和ermB耐药基因电泳结果见图1和图2。

表2 42株粪肠球菌的药敏情况Table2 Drug susceptibility rates of 42 stains of Enterococcus faecalis

2.3 42株粪肠球菌耐药表型与基因型比较42株耐四环素的粪肠球菌有38株检出tetM基因，符合率为90.5%。耐红霉素的35株粪肠球菌中有29株检出ermB，符合率为82.9%；6株对红霉素中介的菌株中2株检出ermB。13株耐万古霉素的粪肠球菌中有2株同时检出VanA、VanB、VanC基因；对万古霉素中介或敏感的29株菌有15株检出VanB，24株检出VanC；只有2株对万古霉素敏感的粪肠球菌未检测到VanA、VanB、VanC。31株对高浓度庆大霉素或高浓度链霉素耐药粪肠球菌中，全部检出氨基糖苷类修饰酶基因Aac(6)'/aph(2'')，27株检出aph(3)'-Ⅲ，24株检出ant(6)'-Ⅰ；11株对氨基糖苷类药物敏感菌株有6株检测到Aac(6)'/aph(2'')，2株检出aph(3)'-Ⅲ，2株检出ant(6)'-Ⅰ。从耐药表型与基因型的比较中可发现有些菌株表型耐药但未检出耐药基因，也有些菌株表型敏感但检测出有耐药基因，详见表4。

表3 42株粪肠球菌耐药基因的检出率Table3 The detection rate of resistance genes in 42 stains of Enterococcus faecalis

图1 aph（3）'-Ⅲ基因的PCR扩增电泳图Fig.1 PCR amplifi cation of aph（3）'-Ⅲ gene

3 讨论

本研究结果显示，湖南省临床分离的42株猪源粪肠球菌对于抗生素的耐药性相当高，尤其是对四环素全部不敏感。对氯霉素、苯唑青霉素、米诺霉素、红霉素的耐药率均在80%以上，对左氧氟沙星的耐药率也达到了57%。发现了对万古霉素耐药的粪肠球菌13株，并有26.2%的粪肠球菌对万古霉素呈耐药中介。对青霉素G的敏感率为88.1%，表明青霉素G是治疗粪肠球菌感染较好的抗生素。本次所测得的结果全部比罗燕萍等[5]在医院监测的结果高出许多，这可能是因为兽医用抗生素不仅仅用于预防和治疗疾病，还作为生长促进剂添加在动物饲料中以增加经济效益[6]。

图2 ermB基因的PCR扩增电泳图Fig.2 PCR amplifi cation of ermB gene

肠球菌对于四环素的耐药，多是由于可移动性元件介导的tetM基因编码的蛋白质-核糖体保护蛋白（RPPS）和核糖体结合蛋白，二者联合作用，阻止了体内四环素与其药物靶点结合蛋白的结合，从而使细菌对四环素耐药。本研究对于四环素的耐药率高达100%，tetM基因的检出率为90.5%，比刘晶[7]等报道的检测结果显著偏高。现已发现的与红霉素耐药性相关的基因有mefA、ermB，它们共同编码合成红霉素核糖体甲基化酶，这种酶能使23S rRNA的DNA碱基甲基化，从而使该基因不能表达出生物活性物质，使之对红霉素耐药。本研究检测了已报道的由可移动性元件介导的ermB基因，其检出率为87.3%，这与Poeta等[8]的报道结果相似。产氨基糖苷类修饰酶是肠球菌对高浓度氨基糖苷类抗生素耐药的主要原因，其中以双重功能酶6'位-乙酰转移酶/2"位-磷酸转移酶最为重要，该酶由Aac(6)'/ aph(2'')基因编码。第2种为由aph(3)'-Ⅲ基因编码的3'位-磷酸转移酶。第3种为由ant(6)'-Ⅰ基因编码6 位-核苷转移酶[9]。本研究对于这几种基因的检出率较高，Aac(6)'/aph(2'')、aph(3)'-Ⅲ、ant(6)'-Ⅰ的检出率分别为97.6%、76.2%、90%。万古霉素耐药基因可编码D-丙氨酰-D乳酸、D-丙氨酰-D-丝氨酸及D-丙氨酰等粪肠球菌细胞壁的前体，使其靶点对于万古霉素的亲合力下降，从而产生耐药性。目前,已经发现的耐万古霉素的基因型有VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG、VanL、VanM和VanN 9型[10]，本研究仅检测了VanA、VanB、VanC三种基因的存在。其中有2株对万古霉素耐药菌株含有VanA基因，而VanB、VanC的检出率分别为54.8%、88.1%。

表4 42株菌株耐药表型与耐药基因比较Table4 Resistance phenotypes and genes in 42 stains of Enterococcus faecalis

从表型与基因型共同分析粪肠球菌的耐药性，发现湖南省兽医临床分离株耐药表型的检出率或是耐药基因的检出率都相当高，粪肠球菌的多重耐药性严重。全部细菌都至少对3种或3种以上的抗生素耐药且同时检出3种或3种以上的耐药基因，其中有3株粪肠球菌对11种抗生素均耐药，1株粪肠球菌携带有所检的全部8种耐药基因。研究中还发现有些细菌具有某种耐药基因，却不一定表现出相应的表型，这可能是与细菌体内各基因是否表达或表达的量是否达到可行使其生物学功能的阈值有一定的关系。也有部分细菌表现为表型耐药但未检测到相关耐药基因，这表明细菌可能还含有其他耐药基因或者还有其他的耐药机制。粪肠球菌耐药表型与耐药基因并不完全一致，因此在检测细菌的耐药情况时，不能仅检测细菌的耐药表型，还应该在基因水平上来发现细菌的隐性耐药，为更合理的使用抗生素提供依据。

参考文献

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[4] 张姝, 莫非, 黄志卓, 等.肠球菌属耐药基因检测及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志, 2012, 22(3)∶ 457-460.

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DRUG RESISTANCE OF SWINE ENTEROCOCCUS FAECALIS IN HUNAN PROVINCE

WANG Song-lin, LI Yun-fang, LIU Qiu-ju, ZHU Na, JIANG Wei, DENG Zhi-bang, LI Man-xiang

(College of Veterinary Medicine, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China)

The aim of this study was to determine the drug resistance of Enterococcus faecalis and the genes related to resistance.Total 42 isolates were evaluated for their sensitivity to 11 antimicrobial drugs by K-B disc diffusion method and for the presence of 8 resistance genes in PCR.All 42 isolates of Enterococcus faecalis were highly resistant to most antimicrobial drugs.The drug resistance percentages of these isolates to acheomycin, chloramphenicol, oxacillin, erythromycin, minocycline, levofloxacin, gentamicin, streptomycin, ciprofl oxacin, vancomycin and penicillin G were 100%, 92.9%, 88.1%, 83.3%, 81%, 57.1%, 52.4%, 47.6%, 45.2%, 31% and 11.9%, respectively.The percentages of drug resistance genes were Aac(6)'/aph(2'')97.6%, ant(6)'-Ⅰ 90%, aph(3)'-Ⅲ 76.2%, tetM90.5%, ermB 73.8%, VanA 4.8%, VanB 54.8% and VanC 88.1%, respectively.In addition, analysis of multi-drug resistance of Enterococcus faecalis did not fi nd relationship between phenotypes and resistance genes.

Enterococcus faecalis; drug resistance; resistance genes

文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2015）02-0041-06

2014-12-15

湖南省科技计划项目（2013FJ6060）

王送林，女，硕士研究生，预防兽医学专业

黎满香，E-mail∶ manxiangl@163.com