白桦脂酸联合硼替佐米诱导U266细胞凋亡及其机制研究

·基础研究·

白桦脂酸联合硼替佐米诱导U266细胞凋亡及其机制研究*

网络出版时间：2015-09-11网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2242.006.html

孙嘉1**， 马丹2， 王萍2， 方琴3***

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学附院 血液科， 贵州 贵阳550004； 3.贵州医科大学附属白云医院 药剂科， 贵州 贵阳550014)

[摘要]目的： 探讨白桦脂酸(BA)联合硼替佐米诱导多发性骨髓瘤(MM)U266细胞凋亡及其机制。方法：用不同浓度的BA(20、40、60及80 mg/L)、硼替佐米(10、80及320 nmol/L)、40 mg/L BA分别联合10、80及320 nmol/L硼替佐米(联合1～3组)处理U266细胞，MTT法检测上述各组U266细胞增殖抑制率；Real-time PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测40 mg/L BA、80 nmol/L硼替佐米及40 mg/L BA联合80 nmol/L硼替佐米(联合4组)的U266细胞Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax的 mRNA和蛋白表达水平。结果：联合1～3组对U266细胞增殖抑制率显著高于BA组和硼替佐米组(P<0.05)；与硼替佐米组和BA组相比，联合4组U266细胞的cyto-C,Bax mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，而Survivin、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论：BA联合硼替佐米可以促进MM肿瘤细胞凋亡，机制可能与下调Survivin、Bcl-2表达，上调Cyto-c、Bax表达有关。

[关键词]白桦脂酸； 硼替佐米； U266细胞； 凋亡； 基因表达

[基金项目]*国家自然科学基金(No:81360501)**贵州医科大学2012级硕士研究生***通信作者 E-mail:47420755@qq.com

[中图分类号]R733.3； R34-33

Research on Betulinic Acid Combined with Bortezomib

Inducing U266 Cell Apoptosis and Its mechanism

SUN Jia1, MA Dan2, WANG Ping2, FANG QIN3

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.DepartmentofHematology,Affiliated

HospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepartmentofPharmacy,

BaiyunHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550014,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate betulinic acid combined with bortezomib inducing apoptosis of multiple myeloma (MM) U266 cells and its mechanism. Method:U266 cells were treated with betulinic acid(20 mg/L, 40 mg/L, 60 mg/L, 80 mg/L), bortezomib (10 nmol/L, 80 nmol/L,320 nmol/L), BA(40 mg/L) combined with 10 nmol/L, 80 nmol/L, 320 nmol/L bortezomib (combination 1～3 groups). The proliferation inhibition rate of U266 cells was detected by MTT assay; Real-time PCR and Western blot were applied to detect mRNA and protein expression levels of Survivin, Cyto C, of BCL-2 and Bax in 40 mg/L BA group, 80 nmol/L bortezomib group and 40 mg/L BA combined with 80 nmol/L bortezomib group. Results: Proliferation inhibition rate of U266 cells in combination 1～3 groups was significantly higher than that in BA group and bortezomib group (P<0.05); compared with BA group and bortezomib group, mRNA and protein expression levels of Cyto C，Bax in the combination 4 group were remarkably increased (P<0.05), the Survivin, Bcl-2 mRNA and protein expression levels were significantly decreased (P<0.05). Conclusions: The betulinic acid combined with bortezomib is proved to induce apoptosis of MM cells and its mechanism may be associated with the down-regulation of Survivin, BCL-2 and up-regulation of Cyto-c, Bax expression levels.

[Key words] betulinic acid; borezomib; U266 cells; apoptosis; gene expression

多发性骨髓瘤(MM)是多发于中老年的恶性血液肿瘤之一，是发生在B淋巴细胞终末阶段的恶性浆细胞病变[1-3]。近年来，临床上多采用以硼替佐米或来那度胺为基础的化疗方案，联合环磷酰胺、阿霉素等药物进行诱导化疗，但因MM是不可治愈性疾病，需长期治疗[4-5]。白桦脂酸(Betulinic Acid，BA)作为一种从五环三萜类化合物，具有显著的抗炎、抗HIV、免疫调节及抗肿瘤作用[6-7]，可诱导白血病、肝癌等多种肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞却没有杀伤力[8-9]。BA联合硼替佐米对MM细胞株U266细胞的作用机制尚不清楚[10]，本研究采用BA联合硼替佐米诱导U266细胞的凋亡，探讨其凋亡的可能机制。

1材料和方法

1.1材料

人MM细胞 U266(获赠于湘雅医学院附属第2医院血液科)。BA购于Alexis公司，硼替佐米购自美国Millennium公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清均购于Gibco公司；β-actin、Survivin、BCL-2、Bax及Cyto-c单克隆抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司，AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT购于美国AxyPrep公司，PrimeScriptTMRT reagent KIT、SYBR Premix Ex TapTM实时荧光定量 PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养U266细胞接种于含15%的RPMI-1640培养基中，37 ℃,5%CO2条件下培养，隔天换液，取对数生长期细胞进行相关实验。

1.2.2细胞增殖抑制率检测 U266细胞按5×103个/孔接种于96孔板，在37 ℃，5% CO2条件下培养，分别用BA(20、40、60及80 mg/L)、硼替佐米(10、80及320 nmol/L)和40 mg/L BA分别联合10、80及320 nmol/L硼替佐米(联合1～3组)处理U266细胞，每种浓度设5个复孔，同时设对照组，于5% CO2，37 ℃的培养箱中培养(BA组分别培养24 h、48 h及72 h，硼替佐米组和联合1～3组培养48 h)，然后每孔加入5 g/L MTT溶液10 uL，继续温育4 h，终止培养，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，震荡10 min，使结晶充分溶解，并用酶联免疫检测仪在490 nm波长处检测各孔的吸光度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。根据增殖抑制率和浓度计算药物诱导肿瘤细胞凋亡50%的浓度(IC50)值，IC50=lg-1[Xm-I(ΣP-0.5)](Xm,设计的最大药物浓度的对数值；I,各浓度倍比浓度的对数值；ΣP,各组生长抑制率之和；0.5为经验常数)，根据IC50值求得最适浓度。以BA和硼替佐米最适浓度及二者联合分别处理U266细胞48 h后进行Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax mRNA和蛋白表达水平的检测，同时设对照组。

1.2.3检测Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax mRNA 采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法，分别取对照组、BA(40 mg/L)组、硼替佐米(80 nmol/L)组及40 mg/L BA联合80 nmol/L硼替佐米(联合4组)U266细胞，用AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT试剂盒提取细胞总RNA；按PrimeScriptTMRT reagent KIT和SYBR Premix Ex TapTM实时荧光定量 PCR试剂盒说明书分别进行cDNA的合成和Real-time PCR反应，以β-actin作为内对照。各基因引物序列见表1。

表1　Survivin、BCL-2 、Bax、 Cyto-C及β-actin引物序列

1.2.4检测Survivin，Cyto-C，BCL-2，Bax蛋白表达 采用Western blot法，按照1.2.3方法取U266细胞，加入了细胞裂解液后冰上孵育30 min，超声粉碎仪进行超声粉碎。4 ℃ 12 000 rm/min离心20 min，取少量上清以Bradford 法测定蛋白浓度。取25 μg 蛋白经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 电转移至PVDF 膜上，PVDF 膜经封闭液室温封阻1 h，加入一抗4 ℃摇床过夜。用辣根过氧化物酶标记的二抗检测蛋白表达。并用β-actin作为内参，计算Survivin、Cyto-C、BCL-2及Bax蛋白的表达。

1.3统计学处理

所得数据采用SPSS 17.0统计软件处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1BA、硼替佐米及BA联合硼替佐米对U266细胞增殖的影响

单用BA和硼替佐米处理U266细胞随着药物的浓度增加增殖抑制率显著升高，且BA还随处理时间的延长也增强，各组比较差异有统计学意义 (P<0.05);而硼替佐米组增殖抑制率明显高于联合1～3组(P<0.05)；BA处理U266细胞24、48及72 h的IC50值分别为(76.27±1.83)、(42.80±2.18)及(29.64±2.53)mg/L，3者比较差异有统计学意义(P<0.05)；硼替佐米组IC50值为(69.71±2.82)nmol/L，根据IC50计算出BA和硼替佐米作用于U266细胞最适浓度分别为40和80 nmol/L。见图1。

2.2检测Survivin、Cyto-c、BCL-2及Bax mRNA 和蛋白表达

与对照组相比，单用BA组或硼替佐米组 Survivin、Bcl-2的mRNA及蛋白表达显著降低，Cyto-C、Bax的mRNA和蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与BA组和硼替佐米组比较，联合4组Cyto-C和Bax的mRNA及蛋白表达水平显著升高，Survivin、Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(p<0.05)。见图2、图3。

图1　BA、硼替佐米及BA联合硼替佐米对U266细胞增殖抑制的影响. Fig .1　The inhibitory effects of BA, bortezomib and BA combined with bortezomib on proliferation of U266 cells.

3讨论

MM是骨髓浆细胞恶性疾病，临床上沙利多胺、马法兰等化疗药物均作为治疗MM首选药[11]。目前大多数MM患者的寿命得以延长，生活质量提高，但MM的化疗效果不持久易复发、易产生耐药性、副作用多等因素在临床治疗中仍难以攻克[12-13]。在本研究中，分别单用BA、硼替佐米以及BA联合硼替佐米共同处理体外培养的U266细胞，实验结果表明，单用BA或硼替佐米处理U266细胞，随着药物的浓度增加增殖抑制率显著升高，且BA还随处理时间的延长也增强对U266细胞的增长抑制率(P<0.05)，但单用硼替佐米硼替佐米组可能由于耐药导致增殖抑制率明显低于BA联合硼替佐米用药组，这提示BA联合硼替佐米用药可以诱导U266细胞凋亡，为临床治疗MM疾病提供了新的治疗思路。

诱导细胞凋亡已成为肿瘤治疗研究中的一项重要课题。通过信号通路激活或抑制，使细胞产生一些凋亡蛋白，并具有较强的抑制细胞增殖和凋亡能力，如BCL-2、Bax、Cyto-c等。本实验研究表明，单用硼替佐米组或BA组Survivin、 BCL-2的mRNA及蛋白表达较对照组显著降低，而Cyto-C，Bax mRNA和蛋白表达显著升高，同时联合组较单用硼替佐米组和BA组Cyto-C和Bax mRNA及蛋白表达也显著升高，Survivin，BCL-2 mRNA及蛋白表达明显降低，提示经BA联合硼替佐米处理U266细胞后，可以上调Cyto-C、Bax基因表达水平，下调Survivin、Bcl-2基因表达水平，促进肿瘤细胞凋亡，抑制其生长，说明BA联合抗肿瘤药物诱导U266细胞凋亡可能是通过上调促凋亡因子的表达及下调抗凋亡因子的表达来实现。

(1)与对照组相比，P<0.05； (2) 与BA组相比，P<0.05； (3)与硼替佐米组相比，P<0.05 图2　处理后U266细胞中Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax mRNA表达水平 Fig. 2　Effect of betulinic acid combined with bortezomib on the mRNA expression levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax

A为对照组， B为BA组，C为硼替佐米组，D为联合4组 (1)与对照组相比，P<0.05； (2) 与BA组相比，P<0.05； (3)与硼替佐米组相比，P<0.05 图3　处理后U266细胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2的mRNA及Bax蛋白表达水平 Fig. 3　Effect of betulinic acid combined with bortezomib on mRNA levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，and protein levels of Bax.

4参考文献

Pluta RM，Lynm C，Glass RM．Multiple myeloma[J]．JAMA，2010 (21)：24-30.

[2]Alexanian R, Delasalle K, Wang M, et al. Curability of multiple myeloma [J]. Bone Marrow Res, 2012 (91)：64-79.

[3]Reece D. Update on the initial therapy of multiple myeloma [J].Am Soc Clin Oncol Educ Book, 2013(33):307 -312.

[4]Kastritis E，Zervas K，Symeonidis A，et al．Improved survival of patients with multiple myeloma after the introduction of novel agents and the applicability of the International Staging System (ISS)：an analysis of the Greek Myeloma Study Group (GMSG)[J]．Leukemia，2009 (6)：1152-1157．

[5]Rosifiol L，Oriol A，Teruel AI，et a1．Superiority of bortezomib，thalidomide．and dexamethasone(VTD)as induction pretransplantation therapy in multiple myeloma：a randomized phase 3 PETHEMA/GEM study [J]．Blood，2012 (8)：1589-1596．

[6]Yu D，Morris-Natschke SL，Lee KH，et al．New development in natural products based anti-AIDS research [J]．Med Res Rev，2007 (1)：108-132．

[7]Mukherjee R，Kumar V，Srivastava S K，et al．Betulinic acid derivatives as anticancer agents：structure activity relationship [J]．Anticancer Agents IVied Chem，2006 (6)：271-279．

[8]Kikucht T, Akazawa H, Tabaka K, et al. 3-O-(E)-p-coumaroyl tormentic acid from eriobotrya japonica leaves induces caspase-dependent apoptotic cell death in human leukemia cell line[J]. Chem Pharm Bull, 2011 (3):378-381.

[9]Szuster-ciesielsja A, lewka K, Danluk J, et al. Betulin and betulinic acid attenuate ethanol-induced liver stellate cell activation by inhibiting reactive oxygen species(ROS), cytokine (TNF-α, TGF-β) production and by influencing intracellular signaling[J]. Toxicology, 2011 (3): 150-163.

[10]Kessler J, Mullauer F, De roo G, et al. Broad in vitro efficacy of plant-derived betulinic acid against cell lines derived from the most prevalent human cancer types[J].Cancer Lett, 2007 (1): 132-145.

[11]Kumar SK, Rajkumar SV, Dispenzieri A, et al. Improved survival in multiple myeloma and the impact of novel therapies [J]. Blood, 2008 (5):2516-2520.

[12]Kim SJ，Kim K，Kim BS，et a1．Clinical features and surviva1 outcomes in patients with multiple myeloma：analysis of web-based data from the Korean Myeloma Registry[J]．Acta Haematol，2009 (4)：200-210．

[13]Jasielec JK, Jakubowiak AJ.Current approaches to the initial treatment of symptomatic multiple myeloma [J]. Int J Hematol Oncol, 2013 (1):133-139.

(2015-05-22收稿，2015-07-30修回)

中文编辑： 吴昌学； 英文编辑： 周凌

中医古代文献的引用规范

中医论著中或多或少会引用中医古代文献的内容，因其特殊性，现总结如下：

1.中医古代文献原则上应引用第一手材料，即单行本，古代的一些类书、丛书，如《医部全录》《徐氏医书八种》，多为后人所集，非原著者所撰，容易有抄写之误，尽量不选。

2.引用时尽量选用最早的或学术界公认最好的版本，如《素问》以选赵开美的本子为宜，以防以讹传讹，并要整句引用，不可断章取义，以免产生误解。

3.书名要注意写全称，以免混淆。如《备急千金药方》不能写成《千金方》，是为了与孙思邈的《千金翼方》区别。

4.引用中医文献的出处(也称书证)要列到2级或3级，要视书的规模和标题层次而定，原则是便于读者查找原文，如《济阴纲目·调经门·脉法》；但其中“卷”、“篇”会因书的版本不同而不尽相同，所以不作为一级的单位。

5.引用文献中的计量单位多与现代用法不同，如斤、两、钱、匕、字等，即使“克”，古代用量也与现代不同。为安全起见，应依据《量和单位》、《中华人民共和国药典》等国家标准折合成克，并在括号中注明。

《贵阳医学院学报》编辑部