慢性氟中毒大鼠血细胞MGMT与hMLH1基因mRNA的表达

·特约专论·

慢性氟中毒大鼠血细胞MGMT与hMLH1基因mRNA的表达*

**通信作者 E-mail:xiaolan76@163.com

网络出版时间：2015-09-11网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2319.058.html

王煜蘅1， 苏艳丽2， 吴昌学1， 李毅1， 官志忠1,3， 齐晓岚1**

(1. 贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳550004； 2.贵阳护理职业学院 检验系， 贵州 贵阳 550081； 3. 贵州医科大学 病理学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 研究慢性氟中毒大鼠血细胞中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因(MGMT)及错配修复基因(hMLH1)mRNA表达水平。方法： 采用饮水加氟法复制20只慢性氟中毒大鼠模型为染氟毒组，另取20只大鼠饮用含氟量<0.5 mg/L自来水为对照组，两组大鼠饲养6月时，观察大鼠氟斑牙的形成，鉴定染氟是否成功，同时采取股动脉放血处死大鼠，提取大鼠血细胞总RNA ，实时荧光定量 PCR 法检测染氟毒组及对照组大鼠 MGMT、hMLH1基因 mRNA 水平。结果： 染氟组20只大鼠全出现氟斑牙，表明染氟成功；氟中毒大鼠血液 MGMT、hMLH1 基因mRNA 表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论： MGMT和 hMLH1 mRNA水平降低可能是氟中毒引起DNA损伤的机制之一。

[关键词]O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因； 错配修复基因； 氟化物中毒，慢性； 大鼠,Sprague-Dawley； 模型，动物

[基金项目]*国家科技支撑计划项目(2013BAI05B03); 国家自然科学基金资助项目(81160335); 贵州省科技厅重点项目 [黔科合计Z 字(2012)4010]; 贵州省科技厅国际合作项目[黔科合外G字(2011)7014]; 贵州省科技厅科技计划项目 [黔科合LG字(2012)009]

[中图分类号]R599.5； R34-33

The Changes of Expression ofMGMTandhMLH1 mRNA

Levels in the Blood Cells of Chronic Fluorosis Rats

WANG Yuheng1, SU Yanli2， WU Changxue1, LI Yi1, GUAN Zhizhong1, QI Xiaolan1

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 2.Department

ofLaboratoryScience,GuiyangNursingVocationalCollege,Guiyang550081,Guizhou,China; 3.Department

ofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate the effects of chronic fluorosis on the DNA repair gene O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase (MGMT) and human mismatch repair gene(hMLH1) mRNA levels in blood cells. Methods: Establish the model of chronic fluorosis rats by adding sodium fluoride to the drinking water of 20 fluorosis rats, and another 20 rats take the water with fluoride content less than 0.5 mg/L as control group. After raising them for 6 months then executing them by bleeding femoral artery, collect their arterial blood and extract the RNA, detect mRNA expression level of MGMT, MLH1 gene from each group by real-time fluorescence quantitative PCR. Results: All 20 rats in experiment group showed signs of dental fluorosis, indicating successful fluoride results. The levels of MGMT and MLH1 mRNA were decreased, the transcription difference between the experimental group and control group had statistic value (P<0.05). Conclusion: MGMT mRNA and hMLH1 mRNA expression in the experimental group decrease significantly than the control group, and the reduction might be the reason in the mechanics of DNA injury.

[Key words] O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase; mismatch repair gene; fluorosis,chronic；rats, Sprague-Dawley; models, animal

氟作为一种固有化学物质存在于自然环境，是机体必需的微量元素，但长期或过量的摄入又会导致机体损伤，尤其是造成氟斑牙和氟骨症等骨相损害。有研究表明，氟对中枢神经系统、肾脏、肝脏、甲状腺以及心血管系统都有不同程度的损伤[1]。大量有关氟对DNA损伤的研究，揭示了氟在一定剂量时，可诱导口腔黏膜、肝、神经、生殖、成骨细胞等的DNA损伤[2-3]，氟的DNA损伤与氟的骨相以及非骨相损伤的关系已成为研究的热点，并认为氟化物可以抑制DNA的合成、DNA单链断裂及 DNA氧化损伤[4]。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methyl-guanine-DNA methyl-transferase,MGMT) 基因以及错配修复(Mismatch repair gene,MLHl) 基因是DNA修复系统中重要的基因，本研究采用实时荧光定量PCR (Real Time-PCR)方法对慢性氟中毒大鼠的血液样本进行检测，观察此类基因与氟中毒的关系。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

Trizol (Invitrogen)，异丙醇，氯仿，SYBR Green(bio-rad)，逆转录试剂盒(Invitrogen)，DU640 核酸蛋白分析仪，ABI Step one 型Realtime PCR仪。

1.2实验方法

1.2.1实验动物与分组清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠(贵州医科大学动物实验中心提供)，体质量100～120 g，随机分为对照组和染氟毒组， 20只/组，组内大鼠雌雄各半，用动物实验中心配制的标准饲料喂养，对照组饮用自来水，含氟量低于0.5 mg/L；染氟组饮用加入氟化钠(sodium fluoride，NaF)含量为50 mg/L的自来水。动物室温度约22 ℃，相对湿度约60 %；两组大鼠饲养6月时，观察大鼠氟斑牙形成鉴定染氟是否成功，同时采取股动脉放血方式处死大鼠，收集血细胞，于-80 ℃保存，测定MGMT、MLH1 基因 mRNA 水平。

1.2.2氟斑牙检查采用三度法检查氟斑牙形成情况[5]。Ⅰ度，门牙表面黄白相间，白奎条纹清晰； Ⅱ度，牙表面呈无光泽、粉笔样白色斑; Ⅲ度，牙表面出现小沟、裂纹或部分脱落，牙齿呈锯齿状缺损。根据氟斑牙情况确定动物模型复制是否成功。

1.2.3MGMT及hMLH1 mRNA测定 采用经典Trizol法提取大鼠血细胞总RNA，经核酸蛋白分析仪检测RNA浓度以及纯度。A260/A280比值在1.9～2.1，取3 μg总RNA按照说明书进行逆转录合成cDNA，4 ℃保存。按表1设计MGMT、MLH1和内参β-actin引物，用 Real Time-PCR 测定MGMT及hMLH1的 mRNA 的水平。ABI Step One型实时荧光定量 PCR 仪采集待测基因及内参照 β-actin 扩增各 40 个循环荧光信号，以 Applied Biosystems SDS1.4 软件进行荧光采集和数据分析。SDS1.4 软件分析其 ΔΔCt 值及relative quantity(RQ)值，RQ=2-ΔΔCt。以 β-actin 为内对照，计算染氟毒组与对照组间mRNA和对照组的相对水平。 反应条件为：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，40个循环95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1　 MGMT、 MLH1及 β- actin引物序列

1.3统计学方法

2结果

2.1氟斑牙分度

20例对照组大鼠氟斑牙分度均为0级，而染氟组均出现不同程度的氟斑牙，其中Ⅰ度6例，Ⅱ度7例，Ⅲ度7例。证明氟中毒大鼠模型复制成功。

2.2MGMT和MLH1 mRNA表达

MGMT和MLH1 mRNA 在染氟组大鼠中表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1及图2。

注：A为MLH1，B为MGMT，C为β-antin 图1　MGMT和MLH1基因熔解曲线与循环图(Real Time-PCR) Fig.1　The melting curve and circular fluorescent signal of MGMT and MLH1 gene

(1)与对照组相比,P<0.05 图2　两组大鼠血液样本 MGMT和MLH1基因 mRNA 表达水平 Fig.2　The mRNA expression of MGMT and MLH1 in the blood of fluorosis rats

3讨论

氟性质活泼，氟化物可通过与哺乳动物DNA的共价结合而造成DNA损伤，如DNA单链断裂、 DNA氧化损伤及程序外合成DNA等[5]。一般情况下，任何的DNA损伤，只要修复无差错，则损伤不会发生，此过程依赖于生物体细胞内修复系统的完整与稳定，如果修复系统出现了问题，损伤得不到有效和及时的纠正，就可能导致DNA损伤引起的突变。所以，损伤的最终结果是修复与损伤共同作用、相互平衡所造成的，氟所造成的损伤有可能是加强了对DNA的损伤，也有可能是破坏了修复系统，或者两者皆有。

DNA错配修复(MMR)系统是生物进化过程中的保守基因，具有修复DNA错配、维持基因组稳定降低自发性突变的功能，这一系统由一系列具有特异修复DNA碱基错配功能的酶分子组成[6-7]，MLH1基因是错配修复基因中较为重要的基因，它担负着对错配位点的识别和切除的功能，其功能缺陷使DNA复制时出现的错配难以得到有效修复[8-10]。MGMT是一种高效的DNA直接修复酶，能修复DNA序列中的6-O- 甲基鸟嘌呤即烷化基团对细胞 DNA的损伤，达到保护细胞的作用，尤其与DNA烷基化损伤的修复密切相关，这是一种迅速的、直接的修复方式，在 DNA损伤修复的早期发挥了重要的作用[11-12]。

本研究结果显示，慢性氟中毒大鼠血细胞MGMT、MLH1基因mRNA表达水平较对照组明显降低(P<0.05)，提示过量氟有可能抑制MGMT、MLH1基因的表达，影响了机体的DNA错配修复功能和烷基化基团对细胞DAN损伤的修复，导致DNA损伤，这可能是氟引起DNA损伤的分子机制之一。

4参考文献

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(2015-06-23收稿，2015-08-20修回)

中文编辑： 文箐颍； 英文编辑： 赵毅