CKS1 siRNA对人舌癌Tca8113细胞中CKS1蛋白的抑制作用

CKS1 siRNA对人舌癌Tca8113细胞中CKS1蛋白的抑制作用

徐亚娟孙旭1李烁烯2段秀梅2李树蕾1刘文书2

(吉林省肿瘤医院，吉林长春130012)

摘要〔〕目的探讨CKS1 siRNA对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中CKS1蛋白的干扰作用。方法设计特异性CKS1插入序列，转入Tca8113细胞，应用免疫组化、RT-PCR、Western印迹检测Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达。结果CKS1 siRNA成功导入并抑制了Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达(P<0.05)。结论CKS1 siRNA能抑制Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达，应用CKS1 siRNA治疗舌癌具有可行性。

关键词〔〕CKS1 siRNA；Tca8113细胞；免疫组化；反义RNA ；CKS1蛋白

中图分类号〔〕R739〔

基金项目：吉林省发展和改革委员会资助项目(JF2012C006-8)

通讯作者：刘文书(1966-)，男，副教授，硕士生导师，主要从事颌面部肿瘤基础和临床研究。

1吉林大学临床医学院2吉林大学第一医院

第一作者：徐亚娟(1965-)，女，主任医师，主要从事颌面部肿瘤的临床研究。

CKS1蛋白在恶性肿瘤中的表达增高，可通过对泛素化蛋白的降解，促进肿瘤的发生和发展〔1〕。siRNA可与核糖核酸酶复合物结合形成由RNA诱导的基因沉默复合体，引起转录后基因沉默〔2〕。本实验前期已经发现舌癌中的CKS1蛋白在舌癌中高表达，本研究旨在进一步探讨其应用于舌癌基因治疗的可能性。

1材料与方法

1.1材料人舌癌细胞Tca8113购自北京博枫科生物科技有限公司。小鼠抗人CKS1抗体、RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；SP试剂盒、DAB试剂盒购自福建迈新生物技术开发公司；DMEM培养基(美国，Gibco)、胎牛血清(以色列)购自沃特司公司；siRNA-MateTM转染试剂盒购自上海GenePharma公司；RAPI裂解液、BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；RT-PCR试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公司。所用引物由上海生工生物公司合成。

1.2CKS1 siRNA转染根据GenBank中CKS1 mRNA全序列，在Reyn-okls设计原则基础上，选取针对编码区的两端序列作为RNA干扰靶序列，使用Ambion在线设计软件设计并选取基因特异性插入片段序列。设计引物：5′-UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT-3′ (有意义链)，5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3 (对照链)，将siRNA序列进行2′Ome修饰和5′FAM修饰。体外培养细胞至2.5×104个/ml，并提前1 d将细胞接种在24孔板中，待细胞的汇合度在30%～50%采用siRNA-MateTM转染试剂盒将CKS1 siRNA导入Tca8113细胞(严格按转染试剂盒说明书进行)。37℃，CO2培养箱孵育48 h后倒置显微镜下，采用同一个视野相同放大倍数进行普通光源和荧光观察并拍照，共检测三张不同爬片，检测3个不同的视野。在合成图像中计数绿色荧光细胞，计算转染效率。转染效率=(绿色荧光细胞/总细胞数)×100%。

1.3CKS1干扰效率检测

1.3.1转染前后的免疫细胞组织化学染色检测将转染前后的Tca8113分别接种于盖玻片表面，待细胞达到70%汇合时，用4%多聚甲醛固定，然后采用免疫组织化学方法对CKS1蛋白标记(按抗体说明书进行)，以PBS液代替一抗作为阴性对照。最后用DAB显色，苏木精复染，显微镜下观察。每张图片测量3个不同的视野，每组检测3张不同的细胞爬片，用软件IPP6.0分析平均光密度。

1.3.2转染前后的RT-PCR检测用Trizol提取转染前后Tca8113细胞中的总RNA，根据NCBI-GenBank中公布的CKS1基因全序列确定扩增目的基因片段。根据引物设计原则，应用Primer 5.0软件设计引物：CKS1-正义：5′-CCCACTACCCAAGAAACCAA-3′，CKS1-反义：5′-CCGCAAGTCACCACACATAC-3′； 利用RT-PCR试剂盒进行扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，CKS1的PCR产物为406 bp。图像经Image J软件分析灰度值，进行半定量分析，各组之间的比较以相差2倍上认定为有显著性差异。

1.3.3转染前后Western印迹检测用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RAPI裂解液提取Tca8113细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测蛋白浓度(按试剂盒说明书操作)，调整蛋白浓度使之一致，等量的蛋白质经变性后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，最后采用Western印迹和二氨基联苯胺(DAB)法检测蛋白。图像经Image J软件分析灰度值，进行半定量分析，各组之间的比较以相差2倍以上认定为有显著性差异。

1.4统计学方法采用SPSS11.0进行t检验。

2结果

2.1CKS1 siRNA转染前后的Tca8113细胞表达 转染前Tca8113细胞呈上皮样，有突起，胞质清亮，可见居中的细胞核及明显的核仁，细胞生长状态良好(图1A)。在荧光显微镜下，CKS1 siRNA转染后的Tca8113细胞胞体较大，突起明显减少(图1B)；同一个视野相同放大倍数条件下的荧光观察发现，转染后的Tca8113细胞的荧光强度明显增强(图1C)。CKS1 siRNA的转染率通过合成图像中绿色荧光细胞的数量来计算(图1D)，转染效率=绿色荧光细胞/总细胞数×100%=95%符合实验要求。

图1　CKS1 siRNA转染前后Tca8113细胞的表达

2.2转染前后的细胞免疫组织化学染色转染前Tca8113细胞质内CKS1蛋白表达丰富，灰度值为52 521 700±7 163.689 5。转染后细胞质内CKS1表达明显减少，灰度值35 201 480±9 052.124，转染前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2　转染前后CKS1在 Tca8113细胞中的表达

2.3转染前后的RT-PCR检测转染CKS1 siRNA组的CKS1 mRNA表达明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。见表1，图3。

-：空白对照组；N：阴性对照组； CKS1：转染siRNA组；下图同 图3　RT-PCR检测CKS1 mRNA表达

组别β-actinCKS1CKS1/β-actin空白对照组56.491±4.89241.176±2.151)4.271)阴性对照组45.918±5.22291.068±1.721)6.331)转染siRNA组41.78±3.965.661±0.390.14

与转染siRNA组比较：1)P<0.05，下表同

2.4转染前后Western印迹检测转染48 h后细胞中CKS1蛋白明显减少，与空白对照组和阴性对照组相比差异显著(P<0.05)，提示CKS1蛋白质的合成受阻，但尚有部分CKS1存在。见表2，图4。

图4　Western印迹检测CKS1蛋白表达

组别GAPDHCKS1空白对照组15869.985±14.115299.45±25.031)阴性对照组15170.902±10.344492.23±15.581)转染siRNA组16211.425±18.952246.32±14.52

3讨论

CKS1基因位于人染色体8q21，其相对分子量为9×103，全长有717 bp序列，其中240 bp碱基有编码作用，可编码79个氨基酸〔3〕；是高度保守的Sucl/CKS的家族成员，可通过结合其他周期蛋白依赖性激酶或磷酸化的蛋白调控细胞周期，在细胞有丝分裂过程中，特别是G1期和M期尤为重要〔4〕。 CKS1在很多癌组织中异常表达，陈绍发〔5〕在研究肝癌中发现，CKS1在肝组织中表达增高，明显高于癌旁组织，且随着临床病理分级的升高，其表达出现明显的增高。赵勇等〔6〕检测了直肠癌组织中的CKS1蛋白的表达，结果其在癌组织中获得了高表达且与肿瘤的分化程度相关。Slotky等〔7〕在乳腺癌研究中发现，CKS1的表达水平随着肿瘤的恶性程度和年龄的增长而增高，且与术后复发有关。本研究表明转染CKS1 siRNA能有效降解细胞内的CKS1 mRNA，进而降低CKS1蛋白在舌癌中的表达。因此，将CKS1 siRNA用于舌癌的靶向治疗，可为临床治疗舌癌提供新的思路和方法。

4参考文献

1Lan Y，Zhang Y，Wang F，etal.Aberrant expression of cks1 and cks2 contributes to prostate tumorigenesis by promoting proliferation and inhibiting programmed cell death〔J〕.Int J Cancer,2008;123(4):543-51.

2房宝英.siRNA及其导入体内外方法的研究进展〔J〕.国际病理科学与临床杂志，2006;27(1):44-7.

3陈紫萱，黄如欣，张忠英.Cks1蛋白在恶性肿瘤中的研究进展〔J〕.检验医学与临床,2009;6(9):705-6.

4Tsai YS，Chang HC，Chuang LY，etal.RNA silencing of Cks1 induced G2/M arret and apoptosis in human lung cancer cells〔J〕.IUBMB Life，2005;57(8):583-9.

5陈绍发.Cks1和CyclinD1在老年肝细胞癌中的表达〔J〕.中国老年学杂志，2013;9(33):4556-7.

6赵勇，高建飞，章必成，等.结直肠癌中Cks1、p27kip1和 Skp2蛋白的表达〔J〕.第四军医大学学报，2006;27(2)：168-9.

7Slotky M，Shapira M，Izhak OB，etal.The expression of the ubiquitin ligase subunit Cks1 in human breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res，2005;7(5):737-44.

〔2013-11-03修回〕

(编辑徐杰)