高压氧对老年大鼠脊髓损伤后巨噬细胞极化和神经保护的影响

高压氧对老年大鼠脊髓损伤后巨噬细胞极化和神经保护的影响

耿承奎曹红花1熊鹰余化霖2

(昆明医科大学附属延安医院骨科，云南昆明650051)

摘要〔〕目的探讨脊髓损伤(SCI)后高压氧治疗(HBOT)的效果，尤其对老年大鼠巨噬细胞活化和神经保护的影响。方法建立脊髓钳夹损伤动物模型。大鼠随机分为假手术组，常压空气治疗组〔NBA组，21%氧气、1个标准大气压(ATA)〕，HBOT组(100%氧气，2.8 TAT)，90 min/次，2次/d，共3 d。分别检测三组模型的巨噬细胞活化、细胞凋亡、组织防护和功能恢复情况。 结果SCI环境下HBOT带来显著性变化，M2亚型的数量和水平显著提升，M1亚型的数量下降。这与同步发生的髓过氧化物酶(MPO)活性的衰减、致炎因素〔如白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-17〕的下调有关。坚牢蓝(LFB)和GAP-43染色结果显示，HBOT组的髓鞘形成和轴突再生的水平明显高于NBA组。 结论HOBT可以提升M2亚型巨噬细胞活性，有效地减少SCI相关炎症的发生，这可能促进神经保护并有助于老年大鼠SCI后的功能恢复。

关键词〔〕脊髓损伤；高压氧治疗； 继发性损伤； 巨噬细胞极化

中图分类号〔〕R459.6〔

基金项目：云南省联合基金(2008CD006)；云南省教育厅基金(2011y184)

通讯作者：余化霖(1963-)，男，博士，教授，主任医师，博士生导师，主要从事微创神经外科临床研究。

1云南省肿瘤医院血液科

2昆明医科大学第一附属医院微创神经外科

第一作者：耿承奎(1980-)，男，在读博士，主治医师，主要从事脊髓损伤修复研究。

脊髓损伤(SCI)会导致严重的神经损伤，治疗费用昂贵，且需要长期护理〔1〕。巨噬细胞/小胶质细胞是主要的炎性细胞，巨噬细胞包括两种亚型，M1亚型可产生高水平氧化代谢产物和促炎细胞因子，是机体主要的防御体系，并具有肿瘤细胞杀伤功能，但这也容易造成对健康细胞和组织的附带损害；M2亚型促进血管生成和基质重塑，同时破坏免疫抑制功能〔2〕。高压氧治疗(HBOT)可促进受损组织的愈合，减少炎症反应，使组织含氧水平提高10～15倍以促进毛细血管生成〔3〕。本研究旨在探讨SCI后HBOT的效果，尤其对老年大鼠巨噬细胞活化和神经保护的影响。

1材料与方法

1.1实验动物分组SD大鼠(体重250～300 g)由昆明医科大学动物中心提供。按不同的治疗方法分为假手术组、常压空气治疗组〔NBA组，1个标准大气压(TAT)下21%氧气〕、HBOT组(2.8 ATA下100%氧气)，每组28只。

1.2SCI模型腹腔内注射(0.3 ml)戊巴比妥钠和阿托品1∶1混合物麻醉大鼠。在整个手术过程中，大鼠体温保持在38℃。在T9～T10椎骨行椎板切开术，暴露T11脊髓节段并用微血管夹(BS4 61-0196，25 g闭合力)夹闭10 s。然后取下夹子，缝合肌肉和皮肤层。手术后，皮下注射5～10 ml生理盐水防止大鼠脱水。将动物置于温暖的笼子里过夜，并给予充足的水和食物。每天给大鼠手工协助排尿两次，直到大鼠恢复膀胱反射。对假手术组大鼠只进行椎板切除术。

1.3HBOT治疗过程在钢质动物高压氧舱中，初始充入100%氧气。舱内压力随后在10 min内增加到2.8 ATA，并在治疗过程结束后5 min内逐渐减压到常压。每次均在手术后立即进行HBOT，时间均为90 min，2次/d，持续3 d。舱内保持22℃～26℃和15 L/min氧气流量。

1.4功能评估采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)量表。该量表对功能行为特定部分，如肢体运动、爪安置/位置、步伐、协同、脚趾间隙和尾巴位置进行分析，总分21分。

1.5样本收集在SCI后指定的时间点对大鼠以水合氯醛(500 mg/kg)和4%多聚甲醛PBS溶液心内灌注。脊髓病灶中间2 cm的区域被切掉后，浸泡在同一固定液内过夜；然后放在30%蔗糖PBS溶液内48 h，用恒冷切片机(赛默飞世尔科技公司提供)切成10 μm厚的横向(第3、7、14天共三组脊髓样品)或矢向(第3天脊髓样品)段。每连续切完100 μm厚的脊髓样品时收集一次切片样品。

从已处死大鼠解剖出一段0.5 mm的脊髓中心样品，并用冷裂解缓冲液处理，使用组织匀浆器(Tissue Tearor985370，美国俄克拉荷马州巴特尔斯Biospec公司提供)在冰上匀浆。4℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清液快速冷冻，-80℃储存备用。

1.6巨噬细胞极化将冰冻切片以含0.3%Triton X-100的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)进行透化处理。使用的一抗是小鼠抗精氨酸-1 多克隆抗体(1∶200， 英国剑桥Abcam公司提供)，大鼠抗CD16/32(1∶200， Abcam公司提供)和山羊抗CD206(1∶200， 美国加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司提供)；小鼠抗诱导型一氧化氮合酶(iNOS)(1∶200，Abcam公司提供)。细胞核用DAPI进行复染。所有免疫细胞化学实验操作均重复三次。

1.7髓过氧化物酶(MPO)活性在SCI后第3、7、14天(n=5)，将超声处理后的匀浆物以13 000 r/min和4℃条件下离心15 min，然后将上清液移至新的离心管中，加入含邻联茴香胺二盐酸化物的磷酸钾缓冲液(pH6.0)和过氧化氢，用分光光度计(SPECTRA MAX 190，美国加利福尼亚州桑尼韦尔分子仪器设备公司提供)以460 nm吸光度进行测量。MPO活性定义为在37℃环境下，每分钟消耗1 mmol过氧化物的酶的量，表示为在湿润组织中的毫克单位。

1.8细胞因子的表达水平在SCI后的第3、7、14天，部分脊髓组织的匀浆液混以2 mmol/L的苯甲基磺酰氟(意大利米兰西格玛化学公司提供)保存在PBS中，测量的细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1β和IL-17。按照使用说明，用比色商业试剂盒(美国加利福尼亚州圣迭戈加州生化-诺瓦生化集团公司提供)进行测定。

1.9神经保护使用勒克斯坚牢蓝(LFB)染色测定SCI后第7、28天残存的包绕神经轴突外的髓鞘。每只大鼠的3～5个冠状切片在95%乙醇中脱水并直接浸泡在37℃环境下的LFB(含有95%乙醇)中过夜以进行LFB染色。以蒸馏水冲洗掉多余的染色剂后，再以95%乙醇冲洗。随后，将切片在0.05%碳酸锂溶液中浸泡4 min后，再在70%乙醇中浸泡4 min以区分各切片。用蒸馏水冲洗后，将切片再在95%乙醇中区分5 min，接着用100%乙醇清洗2次，每次5 min。然后，将切片在脱蜡剂(美国乔治亚州亚特兰大国家诊断中心提供)里漂洗两次，用

Permount(Fisher)覆盖，操作结束。外侧索的LFB阳性区域用彩色影像分析仪(日本福井县三谷MacSCOPE公司提供)在光强自动设定、400倍放大倍数下测定颗粒计数。

2结果

2.1功能分析在SCI之前，所有的动物运动功能均正常(BBB=21± 0)。假手术组，所有的动物在损伤后1 d就恢复到BBB 21分。从SCI后第7天起，两个实验组的运动能力逐渐提高。比较而言，在第14、21、28天时，HBOT组的大鼠表现出更高的得分(P<0.05或P<0.01)。见图1。

与NBA组比较：1)P<0.01,2)P<0.05，下图同 图1　BBB运动功能评分(BBB)

2.2巨噬细胞极化HBOT组的iNOS巨噬细胞数量减少，损伤后第3～14天差异最为明显。损伤后第3天进行的矢状位Arg-1(M2亚型)免疫染色反应发现NBA组的创面中心集中少量的阳性细胞；而HBOT组的病损处周围集中较多的Arg-1阳性细胞。强大的Arg-1免疫产物主要集中于阳性细胞的细胞质。HBOT组在损伤后第14天，M2型巨噬细胞得到促进而M1型巨噬细胞被抑制。

2.3发炎反应与假手术组相比，NBA组(P<0.001)和HBOT组(P<0.001)在损伤后第7天，受伤的脊髓节段(T11)的MPO活性显著升高；然而与NBA组相比，HBOT组明显抑制了MPO的活性增加(P<0.05)。在损伤7 d后，IL-1β、TNF-α 和IL-17水平大幅增加。与NBA组相比，HBOT组的IL-1β(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)和IL-17(P<0.01)水平得到明显的抑制。见图2。

A：假手术组；B：NBA组；C：HBOT组 图2　假手术组、NBA组和HBOT组在损伤后第7天的发炎反应

2.4神经保护在损伤后第42天，HBOT组的备用髓鞘明显面积高于NBA组。在损伤后第7、28天，可以在HBOT组观察到一个较大的GAP-43阳性区(图3)。

图3　HBOT对神经备用髓鞘的影响(LFB染色，×400)

3讨论

HBOT经常应用于创伤的早期治疗，取得了显著的效果。近年的研究表明，HBOT可以提高SCI后的神经功能和日常活动，且疗效明显〔3〕。HBOT可以增加血液的含氧量，提高氧的扩散距离，扩张小动脉，改善局部微循环，减轻受伤部位水肿和脊髓周围的缺血/缺氧。这些好处归因于对损伤部位神经元的保护及消除周围神经元继发性损伤〔4〕。本研究提供了新的证据，表明HBOT避免了继发性损伤带来的伤害，同时通过激活M2型巨噬细胞、抑制细胞凋亡提供神经保护而促进功能恢复。

事实上，早期研究表明SCI后巨噬细胞反应在继发性损伤的发展中起着积极而重要的作用。经典活化巨噬细胞(M1亚型)是脊髓损伤后出现的主要类型，这对受损组织有不良影响，包括抑制轴突生长和诱导神经元死亡；然而替代性活化巨噬细胞(M2亚型)则与之相反，可以促进神经轴突再生、新血管的生长和细胞外基质沉积〔5〕。SCI后没有功能恢复，部分原因也许是M1亚型的发生率超过了M2亚型。其他研究也显示，iNOS是损伤后的急性期内经典活化途径表达上升而出现的第一种M1亚型标志〔2，6〕。在此我们发现，产生致炎性细胞因子的iNOS阳性巨噬细胞群(M1亚型)，主要集中在脊髓损伤后损伤部位及周围组织。然而，HBOT减少了脊髓损伤后的急性期内病损部位的iNOS阳性巨噬细胞群。这一发现与以前的报告相似，Huang等〔6〕发现，相比于SCI组，SCI+HBOT组的脊髓中信使RNA(mRNA)和iNOS的蛋白质表达显著减少。另一方面，Arg-1是替代性活化途径和M2亚型巨噬细胞的早期指示因子。我们的数据表明，HBOT对创面中心的Arg1阳性巨噬细胞群(M2亚型)有促进作用；这一结果表明，HBOT可以有效促进M2巨噬细胞形成。此外，HBOT组的功能恢复开始于损伤后第7天，这也是M2水平峰值出现的时间。可以推断，HBOT组中SCI后功能恢复的部分原因是M2的神经保护作用。

以前的研究已经证实了SCI后HBOT的其他积极作用，这与我们的研究一致。Yang等〔7〕表明，HBOT减少了SCI诱导的脊髓水肿，稳定血脊髓屏障，并通过下调IL-6、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达以及上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达促进神经功能的恢复。Dayan等〔8〕通过比较SCI对照组发现，HBOT治疗可以降低脊髓组织酶〔超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)

和一氧化氮(NO)〕的水平。我们的研究表明由于M2巨噬细胞的活化，在损伤后第28天观察到LFB染色阳性率有所增加，表现出明显的神经保护作用，这可能是抑制炎性级联反应而带来的神经元存活增加的结果。此外，相比于对照组，HBOT治疗提高了SCI后第14天运动功能BBB评分，意味着相对于先前的治疗方案，现在的研究从解剖学上的回复得到明显提高。Yang等〔7〕也发现，HBOT干预可以通过下调HMGB1/NF-κB减少由于炎症反应造成的继发性损伤并促进神经功能修复。在此我们发现，HBOT显著降低了半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-9和B淋巴细胞瘤(bcl)-2基因的表达,并且并降低了SCI相关炎症的发展。先前的证据显示，IL-1β和TNF-α在环氧合酶-2〔9〕和活性氧(ROS)的诱导功能中发挥着重要的作用，这是众所周知的造成SCI后继发性神经元损伤的原因。本研究进一步证实，HBOT通过减少IL-1β、IL-17和TNF-α的产生显著降低了脊髓受损大鼠的TUNEL阳性细胞数量，这与以前的研究结果一致。

综上所述，HBOT促进了M2巨噬细胞的形成，且有效地减少了SCI相关炎症的发展，这可能会进一步抑制细胞凋亡，并有助于大鼠SCI后的功能恢复。

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〔2013-05-11修回〕

(编辑徐杰)