马银花花粉萌发和贮藏特性
2015-12-30宋绪忠
杨 华,宋绪忠
(浙江省林业科学研究院,浙江 杭州 310023)
马银花花粉萌发和贮藏特性
杨 华,宋绪忠
(浙江省林业科学研究院,浙江 杭州 310023)
采用不同培养液、不同培养温度不同贮藏时间和温度、-80℃超低温贮藏花粉不同解冻方法对马银花(Rhododendron ovatum)的花粉萌发特性及贮藏特性进行研究,结果表明:在25℃下,用100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L GA3的离体培养液,培养4h花粉萌发率高,可达80%,GA3能促进花粉萌发和花粉管生长;各贮藏温度下的花粉贮藏15 d萌发率都保持在高水平,但室温贮藏花粉45 d失活,3.3℃贮藏花粉45 d萌发率可保持在36.11%,可作为生产应用的贮藏温度;-80℃贮藏的花粉采用30℃水浴解冻2 min效果较好。
马银花;花粉;萌发;贮藏
杜鹃花是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃属(Rhododendron)植物的总称,是我国传统十大名花之一,被世人誉为“花中西施”。马银花(Rhododendron ovatum)是一类常绿灌木,高达4 m,为杜鹃属中的中国特有种。花色有淡紫色、紫色,花朵具有芳香性气味,盛花期形成大片色块,观赏价值高。同时,马银花具有耐修剪,萌枝能力强、抗污染[1]的优点,适宜园林地栽观赏,值得开发应用。马银花的杂交育种常会遇到花期不遇的问题,特别是进行远缘杂交时,这种问题就更为普遍,有时甚至需要使用贮藏1 a的花粉。本研究采用液体培养基,研究了蔗糖、硼酸、GA3等因素对马银花花粉萌发的影响,以期找出适宜花粉萌发及生活力测定的培养液配方,同时比较了不同培养温度、贮藏方法对花粉生活力的影响,为有效开展马银花杂交育种研究提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试苗木种植于浙江省林业科学研究院苗圃内。2013年4月初马银花始花期,早上采集刚开放的花朵,此时花粉还未喷出,花粉量大、生活力好,带回实验室用于试验。
1.2 试验方法
先将花粉进行混合,取等量的花粉加入含有150 μL培养液的1.5 mL离心管中,用1 mL移液器吸取混匀的花粉培养液,滴3滴于单孔凹型载玻片孔内,将载玻片放入保湿的培养皿内于人工气候箱中光照培养。
使用BX51奥林巴斯显微镜,在20×10倍下观察花粉粒,花粉管长度等于或超过花粉粒直径、四合体只要有一个萌发的花粉管即视为已萌发,选择3 ~ 5个视野拍照统计花粉的萌发情况。
花粉萌发率(%)= 萌发花粉粒数/花粉粒总数×100%
花粉管长度根据拍照时的比例进行测量。统计分析使用Excel2003及SPSS13.0软件。
1.3 最佳培养液的确定
将蔗糖、硼酸、GA3设为3个因素,每个因素设3个水平,以花粉萌发率为评价指标,采用L9(34)正交表,进行正交试验确定最佳培养液。因素水平见表 1。花粉置于25℃人工气候箱中光照培养8.5 h,观察花粉萌发情况。GA3为上海同瑞生物科技有限公司生产的75%结晶粉。蔗糖、硼酸为分析纯。
表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels for orthogonal test
1.4 最适培养温度的确定
在15、20、25、28℃ 4个温度下,用4号培养液进行花粉培养,培养4 h后观察花粉萌发情况。
1.5 最适贮藏时间和温度的确定
将60朵花的混合花粉自然阴干1 d后,将花粉分装于1.5 mL离心管中,用封口胶密封,分别放在室温(22 ~ 30℃)、3.3、-22、-80℃的温度环境下贮藏,在5、15、30、45、60、90、120 d观察花粉的萌发情况,确定最佳贮藏时间和温度。花粉使用4号培养液培养4 h。
1.6 超低温贮藏花粉解冻方法
-80℃超低温冰箱贮藏花粉5 d后,取出等量的花粉放入1.5 mL离心管中,进行26℃常温下放置10 min、冰上放置10 min、30℃水浴2 min 3种处理,解冻后检测花粉活力。
2 结果与分析
表2 正交试验结果Table1 The results of orthogonal test
2.1 最佳培养液
利用正交试验的方法,确定马银花花粉萌发的最佳培养液。从表2可以看出,极差最大的是蔗糖,其次是GA3,最小的是硼酸。所以3个因素对萌发率影响的主次关系为蔗糖>GA3>硼酸。
从试验结果来看,以第9号试验为最好,萌发率达96.74%。经极差分析后,蔗糖以3水平为好,硼酸以3水平为好,GA3 以2水平为好,与试验结果一致。方差分析显示,蔗糖对萌发率影响显著(P<0.05),而硼酸、GA3对萌发率影响不显著。
在试验过程中发现,不同配方培养花粉管生长的情况有差异,为了适当缩短花粉培养时间,避免花粉培养液因长时间培养出现一定的蒸发,选出马银花花粉萌发率最高的4个培养液配方,即4、6、8、9号培养液,随机选取30个萌发花粉,测量花粉管的长度。从分析结果可以看出,各培养液间花粉管生长差异极显著,其中 4号培养液花粉管生长最长,是9号培养液的3.45倍,这说明利用4号培养液可以缩短培养时间,而且在配制培养液时还可以节省试剂。
表3 花粉管长度测量结果Table 3 The length of pollen tubes
表4 验证试验结果Table 4 The results of verification test
最后综合考虑,选择4号培养液进行马银花花粉培养,培养时间可缩短至4 h。
为验证该培养液的合理性,进行3批验证试验,从表4结果可知,验证试验结果与正交试验吻合。2.2 最适培养温度
对不同温度的4号培养液培养的花粉进行统计,在25℃下,花粉萌发率达93.55%,是15℃下花粉萌发率的135.6倍,比20℃和28℃下花粉萌发率高3.59倍及2.54倍。方差分析显示,不同温度处理间差异极显著(P < 0.0000)。经过LSD检验,除20℃和28℃花粉萌发率之间无显著差异,其它各温度条件下存在显著差异(P < 0.05)。
表5 不同温度培养花粉萌发率Table 5 The germination rate at different temperature
2.3 最适贮藏时间和温度
将马银花贮藏在室温(22 ~ 30℃)、3.3℃、-22℃、-80℃的温度环境下,分别在 5、15、30、45、60、90、120 d时观察花粉的萌发情况,以新鲜花粉80%的萌发率作为对照。结果显示,除了-80℃条件下贮藏的花粉一直随贮藏时间的延长萌发率下降,其它条件下花粉贮藏0 ~ 15 d时,花粉萌发率有明显的先下降后上升再下降的现象,即为短期被迫休眠现象。
在室温条件下,随着季节的变化,自然气温不断升高,在贮藏45 d时,即5月中旬,气温达到30℃左右,花粉几乎全部失活,无法萌发。而贮藏在低温和超低温下的花粉此时萌发率都保持在30%以上,可以用于花期迟1个月左右的种间杂交。贮藏120 d时,贮藏在低温和超低温下的花粉萌发率保持在14.64% ~ 22.38%,其中以-80℃贮藏效果最差。
方差分析显示,不同贮藏时间间、不同贮藏温度间各花粉萌发率差异显著(P<0.00)。经过 LSD检验,贮藏60、90、120 d间无显著差异,贮藏45 d与贮藏60、90 d间无显著差异,其它贮藏时间间存在显著差异(P < 0.05);室温贮藏与3.3、-22、-80℃条件下贮藏存在显著差异(P < 0.05),而3.3、-22、-80℃ 3种贮藏条件下的花粉萌发率没有显著差异。
表6 不同解冻方法的花粉萌发率Table 6 The germination rate of pollen treated with different thawing methods
2.4 最佳超低温贮藏花粉解冻方法
不同解冻方法对花粉生活力有影响,30℃水浴2 min 与25℃放置10 min两种方法花粉的萌发率间存在显著差异(P < 0.05),以30℃水浴2 min的解冻效果较好,是25℃放置10 min方法的1.96倍。
3 结论与讨论
3.1 不同培养液对花粉萌发的影响
蔗糖是花粉萌发的营养物质和能量来源,不同植物种类甚至品种其花粉离体培养对蔗糖浓度要求不同[2]。这可能是由于不同植物、品种的花粉细胞中内含物含量不同,要求适宜的细胞壁内外渗透压才能生长。胞内渗透压低于胞外易造成胞内水份外渗,高于胞外则造成细胞过分膨胀,都不利于花粉细胞生长。本研究结果也表明,蔗糖是影响马银花花粉萌发的主要因子[3],100 ~ 200 g/L的蔗糖浓度都促进马银花花粉萌发。
适量硼也是花粉萌发和生长所必需,它能促进糖的吸收与代谢,并促进花粉管的伸长生长,在缺硼的情况下会引起土豆花粉败育[4]。本研究认为100 ~ 200 mg/L的硼酸浓度能适合马银花花粉萌发。
关于赤霉素对花粉萌发和花粉管生长的影响虽然有一些报道,但是较多的研究结果认为50 mg/L以下的低浓度赤霉素对花粉萌发和花粉管生长有明显的促进作用[5]。本研究结果认为50 ~ 100 mg/L的GA3促进马银花花粉萌发,200 mg/L的GA3才有抑制作用,马银花花粉相对其他种类能适应更高浓度的GA3浓度,这与卢精林和赵建雄[6]、刘雪莲[7]等的研究结果较为相似。本研究采用张超仪和耿兴敏[8]提出的马银花最佳离体培养液配方50 g/L蔗糖+200 mg/L硼酸,对所采的马银花花粉进行培养,经过24 h仍未见有花粉萌发。但采用本研究的离体培养液4号配方100 g/L蔗糖+100 mg/L硼酸+100 mg/L GA3,经过4 h即可获得80%以上的萌发率,不仅效率高而且效果好。从这进一步说明,一定量的GA3浓度可促进马银花花粉萌发。在杂交育种时,花粉能否在柱头上正常萌发和花粉管能否正常生长到达胚珠完成受精至关重要,对于远缘杂交来说,克服远缘杂交不亲和及杂种不育性更是如此。张雪梅等[9]在研究苹果授粉时发现,自花授粉后24 h自交亲和品种花柱GA3最高,自交不亲和品种花柱GA3含量则无明显变化,而且自交不亲和品种花粉管已停止生长。本研究的液体培养基有利于促进马银花花粉的萌发及花粉管的快速生长,在进行杂交试验时,在柱头上使用此培养液,可能会缩短受精时间,提高坐果率和促进果实发育,实现杂交成功的目的。
3.2 不同培养温度对花粉萌发的影响
对不同温度培养的花粉进行统计,25℃下马银花花粉萌发率高达93.55%,比最低的15℃下萌发率高135.6倍。20℃和28℃花粉萌发率差异不显著。当然,在低温下,部分花粉萌发慢,萌发所需要的时间可能会延长,造成在本研究的培养时间内未观察到。由此可推测,温度对马银花花粉萌发的影响较大,在野外进行授粉,气温对授粉的成功也会造成影响。
3.3 不同的贮藏条件对花粉萌发的影响
马银花花粉贮藏过程中,除了-80℃条件下贮藏的花粉一直随贮藏时间的延长萌发率降低,其它条件下花粉贮藏0 ~ 15 d时,花粉萌发率有明显的先下降后上升再下降的现象。这一现象在梨[10]、枣[11]中有报道,称为短期被迫休眠现象,引起的具体原因有待进一步研究。在室温条件下马银花花粉贮藏45 d几乎全部失活,无法萌发,而贮藏在低温和超低温下的花粉萌发率都保持在30%以上,可以用于花期迟1个月左右的种间杂交。方差分析显示,3.3、-22、-80℃ 3种贮藏条件下的花粉萌发率无差异,说明在一定低温条件下,贮藏温度对马银花花粉贮藏影响不大。从节约生产成本、方便可行来看,3.3℃可作为生产应用的贮藏温度。在较多的研究中认为,贮藏温度越低,贮藏效果越好[12],但不同物种或品种的花粉适宜贮藏温度不同。欧阳英等[13]对密花石斛花粉的贮藏研究结果说明,4℃保存效果比-20℃保存效果好,但比-196℃液氮保存效果差。乔红莲等[14]研究认为百合品种‘Brunello’花粉适合4℃冷藏,吕晋慧等[15]认为杂交育种中可选择4℃贮藏地被菊花粉。在超低温贮藏花粉时,最好先经过解冻再进行培养。本研究结果认为30℃水浴2 min的解冻效果较好。但是在贮藏花粉120 d时,-80℃的贮藏条件并不是最好的,这也许与花粉解冻过程部分死亡有关。
参考文献:
[1] 宋绪忠,杨华,王成. 杭州市十种绿化树种净化大气能力比较[J]. 广东林业科技,2012,28(6):62-66.
[2] 徐叶挺,龚鹏,杨波,等. 不同贮藏条件下引进扁桃花粉活力变化[J]. 新疆农业科学,2011,48(1):60-63.
[3] 郑宝强,王雁,彭镇华,等. 杂种卡特兰花粉萌发和花粉贮藏性研究[J]. 热带亚热带植物学报,2012,20(1):13-l8.
[4] Brown PH,Bellaloui N,Hu H,et al. Transgenically enhanced sorbitol synthesis facilitates phloem boron transport and increases tolerance of tobacco to boron deficiency[J]. Plant Physiol,1999,119(1):17-20.
[5] 何敬房,樊桂敏,苏淑钗,等. 阿月浑子花粉萌发力及授粉研究[J]. 果树学报,2010,27(5):807-811.
[6] 卢精林,赵建雄. 植物生长调节剂对榆叶梅花粉萌发的影响[J]. 经济林研究,2013,31(1):92-96.
[7] 刘雪莲,杨晴晴,秦佳梅,等. 植物生长调节剂对紫丁香花粉离体萌发的影响[J]. 东北林业大学学报,2011,39(10):54-55.
[8] 张超仪,耿兴敏. 六种杜鹃花属植物花粉活力测定方法的比较研究[J]. 植物科学学报,2012,30(1):92-90.
[9] 张雪梅,李保国,赵志磊,等. 苹果自花授粉花粉管生长和花柱保护酶活性与内源激素含量的关系[J]. 林业科学,2009,45(11):20-25.
[10] 赵纪伟,李莉,彭建营,等. 梨不同品种花粉生活力测定及授粉特性研究[J]. 植物遗传资源学报,2012,13(1):152-156, 162
[11] 孙爱芹,韩斌,彭建营,等. 不同枣品种花粉生活力及贮藏方法研究[J]. 中国农学通报,2010,26(1):166-168
[12] 马建伟,王军辉,张守攻,等. 云杉花粉的贮藏及萌发研究[J]. 林业科学研究,2012,25(3):302- 307.
[13] 欧阳英,李秉玲,刘燕. 密花石斛花粉的保存方法研究[J]. 北京林业大学学报,2010,32(6):151-154.
[14] 乔红莲,刘忠华,霍喜颖. 贮藏温度对百合花粉生活力的影响[J]. 北方园艺,2010(5):86-89.
[15] 吕晋慧,赵耀,王媛,等. 地被菊花粉活力和储藏性研究[J]. 园艺学报,2012,39(12):2 483-2 490.
Characteristics of Pollen Germination and Storage of Rhododendron ovatum
YANG Hua,SONG Xu-zhong
(Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China)
∶Experiments were conducted on characteristics of pollen germination and storage of Rhododendron ovatum with different culture solution and temperature, storage duration and temperature, thawing methods after storage under -80℃. The results showed that pollen germination rate topped to 80% with culture medium of 100 g/L sucrose+100 mg/L boric acid +100 mg/L GA3 at 25℃ for 4 hours. The experiments indicated that pollen germination rate and growth of pollen tubes were promoted significantly by GA3. The germination rate kept high 15 days later under each tested storage temperature. The pollen was inactivation 45 days after storage at room temperature. But the pollen germination rate kept 36.11% after storage at 3.3℃ for 45 days. Pollen(stored at -80℃) thawed with 30℃ aqueous bath for 2 minutes had better effect of germination rate.
∶Rhododendron ovatum; pollen; germination; storage
S685.21
A
1001-3776(2015)01-0049-05
2014-04-02;
2014-07-15
浙江省省院合作林业科技项目(2012SY02-1)
杨华(1976-),女,江苏扬州人,副研究员,博士,从事植物遗传育种研究。