微血管密度对食管鳞状细胞癌预后的价值

贾玉峰

252600山东省临清市人民医院肿瘤科

微血管密度对食管鳞状细胞癌预后的价值

贾玉峰

252600山东省临清市人民医院肿瘤科

目的：研究食管鳞状细胞癌组织中CD105标记的微血管密度(MVD)的预后价值。方法：收治原发性食管鳞癌初治患者50例，给予根治性切除术。所有标本预处理后，均采用SP免疫组织化学染色法检测MVD，并随访生存时间。分析其与食管鳞癌临床病理特征和预后之间的关系。结果：食管鳞癌组织中CD105标记的MVD值与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床TNM分期呈正相关(P＜0.05)。Kaplan-meier生存分析及COX回归均显示MVD是影响食管鳞癌预后的独立因素。结论：CD105标记的MVD反映食管鳞癌患者的血管生成情况，与肿瘤生长及转移相关。高MVD者预后不良，是影响其预后的独立因素。

食管鳞状细胞癌；免疫组织化学；CD 105；微血管密度；预后

血管形成对于恶性肿瘤的生长、浸润、转移、复发均有重要作用。检测肿瘤组织内的血管形成有助于判断复发、转移的风险并评估预后。食管癌是我国的高发肿瘤，就诊时多为中晚期，疗效较差。选择合适的预后评估指标，对于了解其恶性程度、选择个性化治疗方案有重要的临床意义。但目前对于食管癌患者的预后指标仍无定论。本研究检测了食管鳞癌组织中CD105标记的微血管密度(Microvessel density，MVD)，并探讨其与临床病理因素及预后的关系，现报告如下。

资料与方法

2008年1月-2009年1月收治行根治性手术切除的原发性食管鳞状细胞癌初治患者50例，男35例，女15例，年龄42～74岁，平均57.3岁。术后病理均为鳞癌，其中高分化19例，中分化24例，低分化7例。按照2009UICC食管癌国际TNM分期标准[1]，T1 4例，T2 12例，T3 31例，T4 3例；N0 11例，N1 19例，N2 16例，N3 4例；M0 50例；Ⅰ期6例，Ⅱ期29例，Ⅲ期19例，无Ⅳ期。胸上段9例，胸中段28例，胸下段13例。50例患者的一般特点，见表1。

试剂：第一抗体CD105为鼠抗人单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBSPH 7.4)、3，3'-二氨基联苯胺(DAB)显色剂、多聚-L-赖氨酸、柠檬酸缓冲液均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

SP免疫组化方法：按照产品说明书进行。石蜡组织切片常规脱蜡，水化；过氧化氢甲醇阻断过氧化物酶，CD105标记的MVD用柠檬酸缓冲液微波抗原修复法修复。滴加羊非免疫血清，室温下孵育10min。复温后滴加二抗，37℃孵育10min。DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封固和观察。PBS为阴性对照，已知的阳性标本为阳性对照。

结果判断标准：CD105表达在血管内皮细胞的细胞膜上，对具有增殖活性的细胞进行标记。MVD计数用Weidner 法[2]，任何呈现棕黄色的内皮细胞或细胞簇与邻近血管其他结缔组织成分清楚区别为1个微血管。首先在低倍镜下扫描，寻找清楚的血管且微血管数最多的区域染色，然后在高倍镜观察5个视野，记录微血管数，其平均值即为MVD。

随访：对所有患者治疗后进行随访，主要通过电话或信件的方式。

统计学方法：采用SPSS 13.0进行统计分析，定性资料用χ2检验、Fisher精确概率检验、非参数检验及Spearman等级相关分析，MVD以±s)表示，定量资料组间比较用成组t检验，多组间比较用单因素方差分析，生存分析用Cox回归分析，检验水准取α=0.05(双尾)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

CD105标记的MVD与食管鳞癌临床病理因素之间的关系：CD105免疫染色定位于内皮细胞，镜下显示癌组织中的微血管形态不规则，呈现不均匀的分布，微血管数最多的区域位于癌巢边缘近间质，大多数形态为簇状，部分呈条索状，见图1。

图1　CD105标记的血管内皮细胞

MVD与患者性别、年龄及原发灶部位、病灶长度、分化程度、食管钡餐分型之间无相关性(P＞0.05)，但与T分期(rs=2.472，P=0.017)、N分期(rs=2.386，P=0.021)、TNM分期(rs=2.351，P=0.023)明显相关。癌组织侵达食管外膜及邻近组织者(T3～T4组)的MVD明显高于仅侵达黏膜固有层、黏膜下层或肌层者(T1～T2组)(t=2.472，P=0.017)；淋巴结转移阳性者(21.47±5.19)明显高于阴性者(15.27±5.25)(t=2.386，P=0.021)；Ⅲ期者明显高于Ⅰ～Ⅱ期者(t=2.351，P= 0.023)，见表1。

表1　CD105标记的MVD与食管癌临床病理因素之间的关系(±s)

表1　CD105标记的MVD与食管癌临床病理因素之间的关系(±s)

注：⋆单因素方差分析，其余均为成组t检验。

项目　MVD　r P性别　　男　20.66±8.58　1.790　0.08 女16.49±6.49年龄(岁)　　≤55　20.23±7.93　0.72　0.475 ＞55　18.65±7.58部位　　胸上段　21.26±6.04　F=0.875⋆　0.259胸中段　22.34±6.78胸下段　20.31±5.97最大径(cm)　　≤3　16.23±5.83　2.506　0.056 ＞3　21.53±8.16大体分型　　髓质型　18.36±6.42　F=0.682⋆　0.213蕈伞型　17.62±6.03溃疡型　18.26±7.51缩窄型　17.58±5.98分化程度　　高分化　19.37±7.52　F=0.056⋆　0.912中分化　19.28±6.30低分化　17.46±5.97 T分期　T1～T2　15.98±5.36　2.472　0.017 T3～T4　21.33±8.22 N分期　N 0　15.27±3.25　2.386　0.021 N 1　18.28±8.41 N 2　21.01±7.23 N 3　23.29±2.48 TNM分期　　Ⅰ～Ⅱ　17.23±6.06　2.351　0.023 Ⅲ22.18±8.79

生存分析结果表明，MVD与总生存时间(OS)呈明显相关(P＜0.005)，高MVD者提示预后不良，见图2。

图2　MVD与总生存率的K-M分析

OS的单因素回归分析：在影响患者OS的多种单因素中，MVD(P=0.006， OR=1.063，95%CI 1.032～1.105)呈显著正相关。肿瘤T分期(P=0.032，OR= 7.146，95%CI2.826～18.070)、N分期(P= 0.047，OR=1.060，95%CI 1.017～7.105) 及TNM分期(P=0.048，OR=5.431，95% CI 2.526～12.071)均与OS呈正相关。肿瘤分期晚及高MVD是食管鳞癌的危险预后因素，见表2。

表2　影响食管鳞癌患者OS的单因素Cox分析

OS的多因素回归分析：多因素回归分析表明，T分期(P=0.043，OR=2.512，95%CI 0.688～9.174)、N分期(P=0.048，OR=2.477，95%CI 1.492～12.486)、TNM分期(P=0.050，OR=1.379，95%CI 2.368～5.160)及MVD(P=0.036， OR= 1.226，95%CI0.798～6.437)均与OS呈显著正相关。肿瘤分期晚及高MVD是食管鳞癌的危险预后因素，见表3。

讨论

新生血管形成是肿瘤赖以生长、转移、复发的病理组织学基础，受多种促血管生成因子和抗血管生成因子的复杂调节。虽然目前尚不清楚其确切机制，但认为其机制是新生血管基底膜不完整，通透性大，肿瘤细胞容易漏过。同时，内皮细胞产生的多种基质降解酶，增加了瘤细胞的浸润和转移[3]。在新生血管形成过程中，瘤组织内的MVD最能代表血管新生的强度和活跃程度[4]。Folkman提出假说认为，新生血管为癌细胞提供营养物质，如果没有新生血管形成，肿瘤体积不会大于2～3mm3。新生血管形成前，通过弥散作用，为癌细胞提供营养物质，血管形成后则变为灌注作用，因此，癌细胞呈指数生长。肿瘤无限制的增长，需要生产大量的新生血管。此外，新生血管还是癌细胞浸润和转移的第一站，新生血管越丰富，癌细胞越容易血行转移。因此，新生血管的形成在肿瘤的发生、发展过程中具有重要的作用。

表3　影响患者总生存时间的多因素回归分析

新生微血管为瘤体增加能量供应，即微血管为肿瘤的快速、无限制增长提供了结构基础[5]。已有大量研究表明，MVD是恶性肿瘤的重要预后因素，随着MVD升高，总生存期及无进展生存期降低[6-8]。与其他血管抗体相比，CD105单克隆抗体更具有特异性，它仅标记癌组织内新增生的微小血管，而不标记已成熟的较大血管[9]。Rau等对比研究了乳腺癌患者CD105标记的MVD和CD34标记的MVD，结果发现，前者与总生存期、无进展生存期呈显著相关，但后者无相关性，多因素分析显示CD105标记的MVD是独立的预后因素[10]。Hardavella等在非小细胞肺癌研究中得出，CD105标记的MVD较低者可获得相对较长的生存期，提示新生的肿瘤微血管在其生长和转移中发挥重要作用，是影响肿瘤预后的独立因素[11]。刘宏斌等研究了80例食管鳞癌、10例正常食管组织中CD105标记的MVD、cyclinD1的表达，发现二者是影响食管鳞癌预后的主要因素，且有独立的预后意义[12]。在本研究中，MVD与性别、年龄、病变部位、原发病灶长度、分化程度、食管钡餐分型无关(P＞0.05)，但与T分期、N分期及TNM分期明显正相关。肿瘤侵达食管外膜及邻近器官者(T3～T4)MVD明显高于仅侵及黏膜固有层、黏膜下层或肌层者(T1～T2)，淋巴结转移阳性者明显高于阴性者，TNM分期为Ⅲ期的MVD亦明显高于Ⅰ～Ⅱ期。生存分析结果表明，CD105标的MVD与OS显著正相关，高MVD提示预后不良。MVD的表达与食管癌浸润深度、淋巴结转移及TNM分期呈显著性相关，高MVD水平患者较低MVD水平患者预后差，进一步说明MVD表达水平升高在促进食管癌的进展中起重要作用。多因素分析表明MVD是食管鳞状细胞癌患者可靠的预后指标，这与其他学者的结论一致[13-14]。

Kaplan-meier生存分析显示，MVD与总生存时间显著相关。另外，肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期均与总生存时间相关。肿瘤分期较晚及高水平MVD是食管鳞状细胞癌的预后危险因素。COX回归分析显示相似结果，T分期、N分期、TNM分期及MVD均与总生存时间显著相关。肿瘤分期较晚及高水平MVD是食管鳞状细胞癌预后危险因素，这与Sakurai等的研究结论一致[15]。

总之，MVD作为一种食管鳞癌的预后指标，越来越受到临床重视，它对于食管鳞癌的诊断、疗效评估、检测复发、判断预后，均有一定参考价值。

[1]Sobin LH,Gospodarowicz MK,Wittekind C. TNM classification of malignant tumors[M]. Oxford:Wiley-Blackwell,2010,7thed: 129-143.

[2]Weidner N,Semple JP,Welch WR,et al.Tumor angiogenesis and metastasis--correlation in invasive breast carcinoma[J].N Engl J Med,1991,324(1):1-8.

[3]Rau KM,Huang CC,Chiu TJ,et al.Neovascularization evaluated by CD105 correlates well with prognostic factors in breast cancers [J].Exp Ther Med,2012,4(2):231-236.

[4]巩合义,张自成,马杰,等.COX-2、VEGF、MVD联合检测对食管鳞癌预后的判断价值[J].山东医药,2009,49(25):40-42.

[5]李旭东,李桂玲,宋贯杰.肾细胞癌内皮抑素的表达与微血管密度相关性研究[J].中国医学创新,2012,9(4):1-3.

[6]Li J,Zhang Y,Zhang W,et al.Contrast enhanced computed tomography is indicative for angiogenesis pattern and display prognostic significance in breast cancer[J].BMC Cancer,2014,14(4):672-675.

[7]Li Y,Li S,Sun D,et al.Expression of 15-hy-droxyprostaglandin dehydrogenase and cyclooxygenase-2 in non-small cell lung cancer:Correlations with angiogenesis and prognosis[J].Oncol Lett,2014,8(4):1589-1594.

[8]Kim YE,Lim JS,Choi J,et al.Perfusion parametersof dynamiccontrast-enhanced magnetic resonance imaging in patients with rectal cancer:correlation with microvascular density and vascular endothelial growth factor expression[J].Korean JRadiol,2013,14(6): 878-885.

[9]Li SL,Gao DL,Zhao ZH,et al.Correlation of matrix metalloproteinase suppressor genes RECK,VEGF,and CD105 with angiogenesis and biological behavior in esophageal squamous cell carcinoma[J].World J Gastroenterol,2007,13(45):6076-6081.

[10]Rau KM,Huang CC,Chiu TJ,et al.Neovascularization evaluated by CD105 correlates well with prognostic factors in breast cancers [J].Exp Ther Med,2012,4(2):231-236.

[11]Hardavella G,Arkoumani E,Dalavanga Y,et al.Prognostic impact of lymphangiogenesis and lymphatic invasion(CD105 expression) in small cell lung carcinoma[J].Anticancer Res,2008,28(1A):343-347.

[12]刘宏斌,钱俊波,杨其昌,等.食管鳞癌中CD105标记的微血管密度、cyclinD1的表达及其预后因素分析[J].临床与实验病理学杂志,2010,26(3):320-324.

[13]Kumagai Y,Sobajima J,Higashi M,et al.Angiogenesis in superficial esophageal squa-mous cell carcinoma:assessment of microvessel density based on immunostaining for CD34 and CD105[J].Jpn J Clin Oncol, 2014,44(6):526-533.

[14]庞霞,郑湘予,李晟磊,等.CD31、CD34和CD105蛋白在食管鳞状细胞癌组织微血管中的表达及意义[J].山东医药,2009,49 (35):7-9.

[15]Sakurai T,Okumura H,Matsumoto M,et al.Endoglin(CD105)is a useful marker for evaluating microvessel density andpredicting prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J].AnticancerRes,2014,34(7): 3431-3438.

Value of microvessel density on the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma

Jia Yufeng
Department of Oncology,Linqing City People's Hospital of Shandong Province 252600

Objective:To study the prognostic value of microvascular density(MVD)labeled by CD105 in the esophageal squamous cell carcinoma tissues.Methods:50 untreated patients with primary esophageal squamous carcinoma were selected.They were given curative resection.After all the samples were pretreated,they were given SP immunohistochemistry to detect MVD,and the survival time was followed up.The relationship between MVD and the clinical pathological features and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma was analyzed.Results:The value of MVD labeled by CD105 in the esophageal squamous cell carcinoma tissues was positively correlated with the depth of tumor invasion，lymph node metastasis and clinical TNM stage(P＜0.05).Kaplan-meier survival analysis and COX regression showed that MVD was an independent factor for affecting the prognosis of esophageal squamous carcinoma.Conclusion:MVD labeled by CD105 can reflect angiogenesis of patients with esophageal squamous carcinoma.It has the relation with tumor growth and metastasis.High MVD indicates a poor prognosis,and it is an independent factor for affecting the prognosis.

Esophageal squamous cell carcinoma;Immunohistochemistry;CD105;Microvessel density;Prognosis

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.31.51