梗阻性黄疸大鼠胆道外引流术前术后肝脏中转化生长因子β1表达

梗阻性黄疸大鼠胆道外引流术前术后肝脏中转化生长因子β1表达

韩云秦伟杨生虎李晓峰杨立平

(青海大学附属医院腹部腔镜外科，青海西宁810001)

摘要〔〕目的探讨转化生长因子(TGF)-β1在梗阻性黄疸大鼠胆道外引流术前后肝脏中的表达。方法监测梗阻性黄疸大鼠胆道外引流术前及术后不同时间组及假手术组TGF-β1的表达强度。结果TGF-β1在梗阻性黄疸大鼠胆道外引流术前表达强度较高，术后3、6、9 d表达强度逐渐下降，与假手术组有明显差异(P<0.05)。结论①TGF-β1在梗阻性黄疸大鼠胆道外引流术前术后肝脏中的表达存在显著差异，术后不同时段差异不同，术后随时间推移TGF-β1表达减弱。②胆道外引流术可改善梗阻性黄疸大鼠肝损伤，越早引流肝损伤恢复越快。

关键词〔〕转化生长因子(TGF)-β1;梗阻性黄疸;胆道外引流

中图分类号〔〕R657.4+3〔

第一作者：韩云(1975-)，男，主治医师，主要从事腹部腔镜外科研究。

对重度梗阻性黄疸患者进行术前胆道外引流减黄是否可以提高手术耐受性及减黄后何时进行手术，选择最佳的手术时机，目前尚存在争议〔1〕。本实验在不同时间点观察梗阻性黄疸大鼠行胆总管外引流手术前后肝脏中转化生长因子(TGF)-β1的表达，以此推断胆道外引流减黄后的最佳手术时机。

1材料与方法

1.1梗阻性黄疸大鼠模型制作选择健康雄性SD大白鼠120只，体重180～220 g〔兰州大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2009-004〕。随机分成8组，每组15只(术后0、3、6、9 d假手术组，行胆道外引流术后0、3、6、9 d实验组)。各组均于手术前晚禁食。均采用苯巴比妥钠(50 mg/kg)行腹腔注射麻醉后，无菌条件下经剑突下正中小切口2 cm进腹，提出十二指肠探及胆总管，假手术组仅游离胆总管，然后关腹。实验组在接近十二指肠处游离出一段长约1 cm的胆总管。用0/3丝线结扎胆总管,然后腹腔注射医用透明质酸钠(1 ml)，用0/3丝线缝合腹壁切口。术后常规喂养。胆总管结扎24 h后，实验大鼠的尿液颜色逐渐变黄并加深，2～3 d后，皮毛开始逐渐转黄，进食开始减少。经胆道引流后尿液及皮毛颜色开始转浅。实验过程中实验组共有6只意外死亡，假手术组无死亡。

1.2胆道置管建模术后10 d，实验组在原切口进腹，找到扩张的胆总管，并将静脉输液针导管(0.55 mm×19 mm)置入胆总管后用0/5丝线双重结扎胆总管，将置入胆总管的引流管在右侧腹壁皮下打隧道后，从隧道引出体外(在大鼠两耳之间，用20#静脉穿刺针穿刺，穿刺针在皮下潜行直达切口右侧，然后自腹壁穿入腹腔内，将穿刺针头端套入胆总管引流管，逐渐退针后，将胆总管引流管通过皮下自大鼠头部两耳之间穿刺处引出体外)，并固定引流管，查看胆总管有无胆漏后，用生理盐水将腹腔冲洗干净，再用0/3丝线缝合腹壁切口。

1.3TGF-β1检测各组于术后0、3、6、9 d采用脱颈法分别处死大鼠。剪取肝脏组织，包埋后制成蜡块,然后制成切片(厚度5 μm), 分别行免疫组织化学染色和HE染色。再检测TGF-β1(Envision法)。TGF-β1是以细胞质着色为主，以细胞质呈现棕色颗粒状为阳性染色标准，并且细胞质的着色高于背景〔2，3〕。按切片中细胞染色的强度计0、1、2、3分(0分：细胞无染色；1分：细胞呈浅黄色；2分：细胞呈棕黄色；3分：细胞呈褐色)；再按切片中显色细胞比例计0、1、2、3分(每张切片随机观察5个高倍视野，并计500个细胞中阳性染色的细胞数。0分：细胞无阳性染色，1分：阳性染色细胞数<30%染色，2分：阳性染色细胞数在30%～70%，3分：阳性染色细胞数≥70%)。每张切片细胞染色积分=比例计分×强度计分。按积分的高低分为4个级别: 阴性(-)0分；弱阳性(+)1～3分；阳性(++)4～6分；强阳性(+++)7～9分〔4，5〕。

1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1肝功能变化实验组各时间点总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和γ-谷氨酰转肽酶(GCT)水平与假手术组差异显著(P<0.05),实验组3，6，9 d上述指标与引流0 d差异显著(P<0.05)。见表1。

表1　两组胆道梗阻外引流前后不同时间点肝功能变化 ± s, n=15)

与假手术组比较：1)P<0.05；与 引流0 d比较：2)P<0.05

2.2各组肝脏组织TGF-β1表达光度实验组各时间点肝脏组织TGF-β1表达光度与假手术组差异显著(P<0.05),实验组3，6，9 d TGF-β1表达光度与引流0 d差异显著(P<0.05)。见表2。

表2两组术后各时间点肝脏组织TGF-β1表达光度

分组0d3d6d9d假手术组1.26±1.381.27±1.351.29±1.391.28±1.41实验组5.94±2.311.42±1.561)3.19±2.161)5.67±2.281)P值0.0210.0360.0310.028

与引流0 d比较：1)P<0.05

3讨论

梗阻性黄疸是肝、胆、胰外科疾病中较常见的一种临床表现，又称为外科黄疸，严重梗阻性黄疸病人外科手术并发症的发生率和死亡率都较高，据报道〔6〕分别为40%～60%、15%～25%；目前术前减黄多采用经皮肝穿刺置管引流(PTCD)及内镜下鼻胆管引流术(ENBD)，虽然术前胆道外引流能降低血液中胆红素浓度, 减轻患者黄疸的程度，但并不能纠正电解质紊乱，改善凝血功能，对个别肝细胞损害严重的黄疸病人减黄效果较差〔7〕。由于胆汁淤积，在肾小管、心肌和胃肠道黏膜下胆盐的沉积直接损害这些脏器的功能，从而引起肾衰竭、心功能下降等一系列并发症，导致特异性和非特异性细胞免疫功能的损害，反而可以增加并发症的发生,如胰漏、胆道出血、胆漏、内毒素血症及术后感染等。

针对能够进行手术治疗的恶性梗阻性黄疸患者，手术前通过胆道外引流改善肝功能及全身状况，为手术创造良好条件的时机选择难度较大〔8，9〕。本研究显示： TGF-β1在梗阻性黄疸大鼠模型肝脏中的表达较高，而胆道外引流术后随着时间的推移肝脏中的表达明显降低。尤其以胆道外引流早期TGF-β1的表达下降趋势较明显。发生梗阻性黄疸不及时外引流干预，肝脏水肿程度逐渐加重，功能受损，胆汁停止分泌，到后期可能产生不可逆的损害〔10，11〕。因此，对梗阻性黄疸诊断明确后，越早进行减黄干预，效果越好〔12〕。

4参考文献

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3唐仕芳，朱洪春，李华强，等.转化生长因子β1在新生大鼠高浓度氧致肺损伤中的作用研究〔J〕.重庆医学,2009; 38(4)：438-40.

4王国辉，蒋桂星，崔云甫，等.TGF-β1在大鼠胆管损伤修复过程中的表达〔J〕.世界华人消化杂志,2010;18(5)：502-5.

5罗斌，王俊利，黄重敏，等.转化生长因子B1 基因单核苷酸多态性与乙型肝炎后肝硬化的相关性研究〔J〕.中华医院感染学杂志，2010；20(10)：1389-92.

6董家鸿,曾永毅.梗阻性黄疸减黄研究热点与难点〔J〕.中国实用外志,2007;10(27)：768-9.

7裘正军，李宝华.梗阻性黄疸对宿主细胞免疫功能的影响〔J〕.国际外科学杂志，1991;5(7):269-71.

8黄立高，张永杰，俞文隆，等.胆道闭合性损伤后手术时机选择的实验研究〔J〕.中华肝胆外科杂志，2001；13(11)：760-3.

9詹国情，董家鸿，王槐志，等.损伤性胆管狭窄手术时机探讨〔J〕.第三军医大学学报，2002；24(9)：1120-1.

10李冰.TGF-β1在梗阻性黄疸大鼠胆道外引流术后胆总管中的表达〔J〕.西宁：青海大学硕士论文，2012.

11李晓峰，张杰，郭俊武，等.TGF-β1在梗阻性黄疸大鼠胆总管中的表达〔J〕.青海医药杂志，2012；42(6)：4-6.

12Patsenker E，Popov Y，Stickel F，etal.Inhibition of integdn alphavbeta on cholangiocytes blocks transforming growth factor-beta activation and retards biliary fibrosis progression〔J〕.Gastroenterology，2008;135：660-70.

〔2013-12-13修回〕

(编辑苑云杰)