丹参注射液对D－半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响

丹参注射液对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆能力的影响

(重庆医科大学干细胞与组织工程研究所，重庆400016)

摘要〔〕目的探讨丹参对D-半乳糖致衰老模型小鼠学习记忆能力的影响及其作用途径。方法120 mg·kg-1·d-1D-半乳糖注射6 w建立衰老小鼠模型，第15天随机分组后，丹参组注射丹参注射液0.1 ml/d连续28 d，空白对照和模型对照组注射等量的生理盐水。水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力；试剂盒测定血清和脑海马组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、单胺氧化酶(MAO)活力及丙二醛(MDA)含量。结果与对照组比较，模型组小鼠学习记忆能力降低，血清和海马组织SOD、GSH-Px 活性下降，MDA含量增加MAO活性升高(P<0.05)；腹腔注射丹参后小鼠认知记忆能力较模型组明显改善，血清和海马组织SOD、GSH-Px 活性明显升高而MDA含量减少(P<0.05)，海马中MAO活性降低 (P<0.05)。结论丹参注射液可改善D-半乳糖致衰老模型小鼠的学习记忆能力，其作用机制可能与改善血液和脑组织中SOD、GSH-Px 活力，降低血液和脑组织中MAO活性、 MDA含量有关。

关键词〔〕丹参；衰老；学习记忆

中图分类号〔〕R961〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.31100985)；重庆市科委自然科学基金(No.CSTC2010BB5096)

通讯作者：郑敏(1972-)，女，教授，硕士生导师，主要从事神经干细胞生物学研究。

第一作者：刘品月(1989-)，女，在读硕士，主要从事神经干细胞生物学研究。

Effect of Danshen on learning and memory abilities in aged mice induced by D-galactose

LIU Pin-Yue,JIN Zhen-Chao,DENG Xiao-Lan,etal.

Department of Stem Cells and Tissue Engineering，Department of Histology and Embryology,Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of Salvia Miltiorrhiza(SM) on learning and memory ability of aging model mice induced by D-galactose.MethodsD-galactose was injected 120 mg·kg-1·d-1 for 42 days to make the aging model mice.15 d after,SM were injected(0.1 ml/d)to the SM group mice for 28 days.Water maze experiment was used to detect the abilities of learning and memory of mice;superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px),monoamine oxidase (MAO) activity and malondialdehyde (MDA) content in serum and brain tissue were checked.ResultsCompared with that of control group,learning and memory abilities of model group was decreased;the levels of SOD,GSH-Px activity in serum and hippocampus tissue were decreased while MAO activity and MDA content were increased(P<0.05).Injection of salvia miltiorrhiza obviously improved learning and memory abilities compared with those of model group;SOD,GSH-Px activity in serum and hippocampus were increased significantly and MDA content was decreased compared with those of model group(P<0.05),MAO activity in the hippocampus was also decreased(P<0.05).ConclusionsSalvia Miltiorrhiza could improve learning and memory abilities of D-galactose induced aging mice through improving SOD,GSH-Px vitality and reducing MAO activity and MDA content in the blood and brain tissue.

【Key words】Salvia Miltiorrhiza；Aging;Learning and memory

衰老是一种复杂的生命现象〔1〕。自由基学说认为衰老与自由基酶活性降低，导致体内氧化自由基增多有关。丹参及其提取物具有改善衰老动物学习记忆作用〔2,3〕。有文献报道丹参对衰老小鼠海马神经细胞的凋亡有抑制作用〔4〕，而海马与学习记忆能力有直接的联系〔5〕。本研究观察丹参注射液对D-半乳糖致衰老模型小鼠学习记忆能力的影响。

因为赛事组委会事先给出15个题库，每个题库有50道选择题。教师只要把题库按照职业基本素养和保育教育两大类别进行归纳整理，对选手概念模糊不清的题目进行辨析，一般都可以得到较为理想的分数，关键是理解记忆的问题。

1材料与方法

1.1材料动物2～3月龄清洁级雄性昆明小鼠共24只，体重18～22 g，重庆医科大学实验动物中心提供。D-半乳糖购自Sigma公司；丹参注射液为正大青春宝产品，批号：国药准字Z33020177；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)定量检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、单胺氧化酶(MAO) 活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；水迷宫分析系统是成都泰盟有限公司产品。

1.2动物分组、给药与模型建立将雄性昆明小鼠随机分为对照组，模型组，丹参组，每组8只。室温维持在20℃～25℃，自然照明，自由饮水和摄食。模型组和丹参组小鼠每天颈背部皮下注射D-半乳糖120 mg·kg-1·d-1，连续注射42 d；对照组注射等量的生理盐水。从第15天开始丹参组每日腹腔注射丹参注射液0.1 ml，连续注射28 d，同时模型组和对照组注射等量的生理盐水。

1.3学习记忆能力测试给药结束后，采用改良的Morris 水迷宫方法〔6〕，测试过程中室温保持在18℃～22℃。在槽壁上等距标记A、B、C、D四个点作为固定入水点。槽中加入清水直至没过平台1 cm，水中加入墨水隐藏平台。测试程序为定位航行试验，训练时每天随机将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其寻找到并爬上隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期)，如果小鼠60 s以上未找到平台，则潜伏期记为60 s，1次/d，共进行8 d，作为判断大鼠学习能力的指标。

1.4血清中SOD、GSH-Px、MAO、 MDA的检测测试结束后，眼眶取全血，促凝管收集，4℃离心3 000 r/min 离心10 min，吸取上清，测定上清液中SOD活性、GSH-Px、MAO活力及MDA含量。SOD测定采用水溶性四氮唑(WST)法，MDA测定采用TBA法，GSH-PX采用比色法，MAO采用紫外比色法，按试剂盒说明书操作。

1.5脑海马组织中SOD、GSH-Px 、MAO、 MDA的检测取血后断头处死，冰盘上迅速取下完整大脑，分离获取海马组织，用预冷的生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，称重，用玻璃匀浆器在冰浴下加入蛋白裂解液研磨成100 g/L的脑组织匀浆液，4 000 r/min 4℃低温离心10 min 吸取上清液，检测方法同1.4。组织中蛋白含量的测定采用BCA法，按照试剂盒说明书进行操作。

2结果

2.1丹参对衰老模型小鼠学习记忆能力的影响与对照组相比，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；丹参组的逃避潜伏期明显短于模型组(P<0.05)，对照组与丹参组间无统计学差异。见表1。

2.2丹参对衰老模型小鼠血清SOD、GSH-Px、MAO、 MDA的影响模型组小鼠血清SOD、GSH-Px 活力下降，MDA含量增加(P<0.01)；丹参组与模型组比较小鼠血清SOD、GSH-Px升高，MDA含量下降(P<0.01)。见表2。

表1　丹参注射液对衰老模型小鼠学习记忆能力

与对照组比较：1)P<0.05;与模型组比较:2)P<0.05;下表同

表2　各组血清SOD、GSH-Px、MDA、MAO 的改变

2.3丹参对衰老模型小鼠海马组织中SOD、GSH-Px、 MDA、MAO含量的影响模型组小鼠海马组织SOD、GSH-Px 活力下降，MAO活性增加，MDA含量增加(P<0.05)；丹参组与模型组比较小鼠海马组织SOD、GSH-Px 升高，MDA，MAO含量下降(P<0.05)。见表3。

表3　各组海马SOD、GSH-Px、MDA、MAO 的改变

3讨论

衰老，通常是指在正常状况下生物体发育成熟后，随年龄增加，自身功能减退，维持内环境稳定能力与应激能力下降，从而导致组织器官结构、功能衰退的不可逆的生理过程。自由基学说是目前公认的衰老机制之一。该学说认为机体在代谢过程中产生自由基，其具有极强的氧化能力导致生物大分子结构和功能的改变，但同时机体又具有有效的自由基清除系统(如SOD等)，使体内自由基维持在正常水平。衰老时这一平衡逐渐被破坏，造成自由基过剩进而导致生物体整体的机能减退〔7〕。在衰老的过程中，神经系统的衰退尤为重要，突出表现为学习记忆认知能力的减退。

丹参是一种中华医学的传统药物，具有活血化瘀、清心安神的功效，目前认为丹参及其提取物具有抗脂质过氧化，提高SOD从而保护组织细胞免遭自由基的损伤的作用，对神经细胞模型结构有一定保护作用〔8〕。本研究认为丹参可能通过抑制自由基反应，从而改善衰老动物学习记忆能力。

D-半乳糖致衰老小鼠模型是国际上认可的衰老模型。该模型小鼠表现为学习记忆功能障碍、免疫功能低下等一系列自然衰老的现象，是进行学习记忆功能、衰老等研究的良好模型。Morris水迷宫实验用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力，被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、智力与衰老、新药开发、筛选、评价等多个学科的科学研究。本文通过D-半乳糖建立的小鼠衰老模型在水迷宫实验中明显表现出脑衰老的症状，学习记忆能力下降，而经过丹参注射液作用28 d后，衰老小鼠的逃避潜伏期明显缩短，小鼠的认知记忆能力得到改善。

SOD和GSH-Px是机体内清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，对维持机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，能清除超氧阴离子自由基(O2-)，保护细胞免受氧化损伤，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。MAO为催化单胺氧化脱氨反应的酶，具有调节生物体内胺浓度的功能，MAO活性的升高会引起整个机体器官功能尤其是脑功能的逐步退化、衰老。MDA是氧自由基攻击生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物，对MDA含量的检测可反映出机体内脂质过氧化和机体细胞受自由基攻击的损伤程度。本实验结果从自由基角度证实了自由基在衰老中的作用。丹参注射液治疗后衰老小鼠血清和脑海马组织中具有抗自由基作用的SOD和GSH-Px的活性显著增加，而MAO活性和MDA含量明显降低。本实验结果提示丹参注射液具有提高衰老小鼠学习记忆能力、延缓衰老的作用，为丹参在抗衰老方面的应用提供了初步的实验依据。丹参抗衰老机制很可能与其提高机体抗氧化能力、清除自由基维持机体内环境平衡有关，但是丹参如何改变SOD和GSH-Px活性、降低MAO活性和MAD含量的作用机制尚不明确；此外，本实验采用的丹参注射液为中药复方制剂，其有效成分包括水溶性丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B等〔9〕，哪种成分在抗衰老中起关键作用，有待进一步研究。

4参考文献

1Kirkwood TB.Understanding the odd science of aging〔J〕.Cell,2005;120(4)：437-47.

2邵荣姿，刘召红，张俭俭.丹参红花提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆的调节作用〔J〕.实用医药杂志,2011;28(7)：627-9.

3程亮星，闰玉华，汪宝军,等.丹参素异丙酯对D-半乳糖致衰老大鼠的抗氧化作用〔J〕.中国中药杂志 2011;36(8)：1094-6.

4朱健，蔡文纬，陈朝婷.丹参对衰老鼠脑海马神经细胞凋亡作用的研究〔J〕.中国老年学杂志,2001;21(1)：46-8.

5Artegiani B，Calegari F.Age-related cognitive decline：can neural stem cells help us〔J〕?Aging,2012；4(3)：176-86.

6聂荣庆，张进，胡国柱,等.脑细胞活性因子对小鼠学习、记忆能力的影响〔J〕.中国行为医学科学,2002;11(5)：488-9.

7Sohal RS.Role of oxidative stress and protein oxidation on the aging process〔J〕.Free Radic Biol Med,2002;33(1)：37-44.

8胡俊勇，刘世敬，杨远良,等.丹参对大鼠脊髓损伤后脊髓血流量及运动功能的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2003;23(6)：167-9.

9李婧，刘汉清，孙小芬.丹参注射液多成分定量检测和指纹图谱研究〔J〕.中成药,2011;33(4)：553-6.

〔2014-10-25修回〕

(编辑袁左鸣)