GABAA受体基因多态性与癫痫易感性的关系

GABAA受体基因多态性与癫痫易感性的关系

张虎杜欣娜1徐敏张淑红王菊莉2张金波朱金玲

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007)

摘要〔〕目的探究γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体的亚基基因GABRG2和GABRB2单核苷酸多态性(SNP)与癫痫(EP)易感性的关系。方法应用限制性片段长度多态性(RFLP)技术对GABAA受体亚基基因GABRB2(rs12653921、rs2964773)、GABRG2(rs2268581)3个标签单核苷酸多态性(Tag SNP)的等位基因和基因型测定分析。结果EP组和对照组等位基因频率和基因型分布比较，SNP(rs12653921)位点(基因型χ2=8.651，等位基因χ 2=8.649)有统计学意义；SNP(rs2268581)、SNP(rs2964773)位点(rs2268581：基因型χ2=0.354，等位基因χ2=0.294；rs2964773：基因型χ2=1.397，等位基因χ2=0.643)无显著差异(P>0.05)。结论SNP(rs12653921)可能与EP易感性相关，SNP(rs2268581)、SNP(rs2964773)可能与EP易感性不相关。

关键词〔〕癫痫；GABAA受体；单核苷酸多态性

中图分类号〔〕R742.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省卫生厅课题(2012-248)

通讯作者：朱金玲(1967-)，女，教授，主要从事癫痫易感性研究。

1佳木斯大学附属第二医院病理科2佳木斯市中心医院癫痫科

第一作者：张虎(1981-)，男，讲师，主要从事癫痫易感性研究。

癫痫(EP)是神经系统内因神经元异常放电而引起短暂的脑功能紊乱的一种多发病，发病机制十分复杂，而神经元的超同步放电引发痫性放电的理论则被一致接受。γ-氨基丁酸(GABA)在中枢神经系统内含量最多的抑制性神经递质，其抑制作用由GABA受体介导，维持了神经元的兴奋与抑制平衡，该平衡被打破导致神经元失去细胞膜稳定性而引起EP发作〔1〕。GABA受体主要包括3个亚型家族：GABAA、GABAB和GABAC受体，其中GABAA受体是目前研究最广泛、与EP关系最密切的亚型。

1对象与方法

1.1研究对象EP组为2012年3月至2013年9月就诊于佳木斯中心医院癫痫中心的EP患者198例，其中男102例，女96例，均为汉族，年龄2个月～70岁，均经过临床确诊(依照1981年ILAE分类和诊断标准)；对照组为同期于本院体检中心健康查体的人员186例，其中男90例，女96例，均为汉族，年龄3～75岁。两组一般资料比较无统计学意义(P>0.05)。

1.2研究方法

1.2.1Tag SNP的选择在Hapmap中分别载入基因GABRB2和GABRG2基因后，在Haploview 4.2软件中运行tagger program选取各自的Tag SNP，并且从中挑选具有限制性酶切位点的SNP位点。选取了GABRB2基因的rs12653921、rs2964773和GABRG2基因的rs2268581。

1.2.2基因组DNA的提取取外周静脉血2 ml，用ACD液(柠檬酸钠1.32 g，柠檬酸0.48 g，葡萄糖1.47 g，加水至100 ml)抗凝，以低渗溶血，裂解白细胞，用chelex-100提取DNA。

1.2.3PCR-RFLP检测GABAA受体基因的多态性①用primer5.0软件设计PCR引物。20 μl PCR反应体系：2×Power Taq PCR Master Mix 8 μl，上、下游引物各0.5 μl，模板DNA 2 μl，加ddH2O至20 μl。各Tag SNP位点PCR反应条件为：95℃预变性5 min，然后进行35个PCR循环(95℃变性30 s、相应温度退火30 s、72℃延伸相应时间)，72℃终末延伸5 min。rs12653921上游引物：ATAGACCAAAAGCTGGGCCTC，下游引物：TGGTCCATGGGCTGTAGAATG，退火温度62℃，延伸时间60 s，片段长度907 bp；rs2268581上游引物：TGGGGTTTGTTTCAGCGTGT，下游引物：CCTAGAACCACATCCCTTGCT，退火温度60℃，延伸时间30 s，片段长度498 bp；rs2964773上游引物：CCTTGCCCCTGGTTTCATCT，下游引物：TCTTGTGTAACTCAGCATTTCTCA，退火温度59℃，延伸时间30 s，片段长度353 bp。②RFLP检测：20 μl的酶切反应体系包括 PCR产物10 μl，限制性内切酶1.5 μl，10×buffer 2.0 μl，ddH20 8.0 μl。其中rs12653921、rs2268581、rs2964773位点的内切酶分别为BglⅡ酶、HincⅡ酶、Taq I酶。 酶切反应体系配好振荡混匀后，置于37℃水浴箱中，酶切时间分别是16 h、4 h、5 min。

1.2.4PCR产物的测定三种基因型部分产物经纯化后进行DNA全自动测序(上海生工)，进行基因型验证。

1.3统计学处理采用SPSS17.0软件进行χ2检验。

2结果

2.1rs12653921结果Rs12653921PCR产物大小为907 bp，其中T/T：498 bp和409 bp；G/G型：907 bp；G/T型：498 bp、409 bp和907 bp。见图1。两组基因型和等位基因频率比较见表1。

2.2rs2268581结果rs2268581 PCR产物大小为498 bp,A/A：388 bp和111 bp；T/T：498 bp；A/T：388 bp、111 bp 和498 bp，见图2。两组rs2268581基因型和等位基因比较见表2。

与对照组比较：1)P<0.05

图2　rs2268581位点酶切图

组别n基因型A/AA/TT/T等位基因ATEP组198489060186210对照组186508254182190

2.3rs2964773结果PCR产物大小为353 bp，其中该位点基因型及等位基因频率比较见表3。C/C：241 bp和112 bp；T/T：353 bp；C/T：241 bp、112 bp和353 bp，见图3。

图3　rs2964773位点酶切图

组别n基因型C/CC/TT/T等位基因CTEP组198609048210186对照组186589236208164

3讨论

在结构上，GABAA受体是异源五聚体配体门控的氯离子通道，包括α(α1-α6)，β(β1-β3)，γ(γ1-γ3);δ，ε，θ和ρ(ρ1-ρ3)亚基基因家族编码的各种蛋白〔2〕，不同亚基在EP发病中起到不同的作用。最常见的组合是2ɑ1 2β22γ2，是脑组织内含量最丰富的组合。GABA和其重要正性变构剂BD的结合位点在ɑ、β亚基上，介导GABAA受体对神经元的抑制性作用，而γ亚基对其抑制作用有重要辅助作用。因此本实验选取了GABRG2及GABRB2基因的3个Tag SNP位点进行基因多态性研究。随着遗传技术的快速发展，GABAA受体亚基基因水平的研究逐渐深入。GABRG2基因第8外显子K289M突变，是发现的第一个与EP相关的GABAA受体基因变异〔3〕。Q351X、第6内含子剪接位点(IVS6+2T→G)突变、第2外显子的R43Q错义变异，主要分布在CAE和GEFS+家系中〔4，5〕。另外，R177G、p.W390X突变，主要与FS和FS+相关，错义突变 (c.236A>G：p.N40S)在GTCS患者中被确定〔6～8〕。GABRB2基因在GEFS+家系中发现第2外显子的C/G多态性〔9〕。第11外显子SNP(1412C>T)导致丙氨酸残基同义突变〔10〕在对北印度人研究中与癫痫易感性有相关性。

SNP是在人类基因组中分布密集的一种分子标记，大约每1 000 bp有一个SNP位点。由于基因连锁不平衡，遗传距离而非物理距离相近的SNP位点的等位基因不是随意组合而是趋于一种组合，而是形成相对固定的单倍型域。单倍型域可大可小，其中的SNP位点数目不定。由于单倍型域内的各个SNP是相互关联的，它们可以用一个位点(或多个位点的组合)代表另外的位点或单倍型，所选的有代表性的位点即Tag SNP。人类基因组单体型图计划中单倍型的图谱的制作就是Tag SNP的应用的成果。Tag SNP在疾病关联分析中被广泛应用。

rs12653921定位于内含子区，作用机制可能是因为碱基的改变影响了mRNA稳定性，不能编码功能性GABRB2基因蛋白质，β2亚基的表达受到了明显的影响甚至表达缺失，最终诱发EP的发生。证实了β2亚基基因变异在EP发病机制中的重要作用，碱基的改变最终都是影响了GABAA受体的组装及其表面表达，增加了癫痫的易感性。SNP(rs12653921)是Tag SNP，也有可能是因其所在的单倍域内其他多态位点与EP易感性相关，而SNP(rs12653921)只是因与其连锁不平衡所致基因型分析有差异，因而不起决定作用。

在GABRG2基因SNP(rs2268581)、SNP(rs2964773)的研究中，未发现与EP易感性有相关性。可能是以下原因所致：(1)EP的发病机制绝大多数是多基因遗传，其发生是几个基因共同作用的结果，所以在样本量难以满足理想样本时，很可能难以发现某一基因的微小作用。(2)在与EP发作相关的基因中的数个SNP位点中，可能仅是其中一部分是在癫痫发作机制中起作用，而另一部分可能仅与其他神经系统疾病相关。(3)种族、地域差异，在以往GABAA受体基因与EP的相关性研究中，同样存在种族不同而相关性结果分析不一致的情况。EP是一组遗传异质性的，以后随着基因工程的技术进展，与EP相关的多态位点将为新药物提供有利依据。

综上所述，GABAA受体基因变异使介导神经元抑制作用的GABAA受体的亚基的合成、组装及表面表达受到影响，受体功能最终减弱甚至缺失以致癫痫发生。越来越多GABAA受体亚基的突变被确定，而且随着基因克隆技术及动物实验技术的进步，很多突变的机制在进一步的试验中得以印证。研究的最终目标是能够针对突变位点研制新的靶点药物，而现阶段的水平还远远不足。需要进一步扩大样本量，来探索GABAA受体基因在EP的发病机制中的作用。

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〔2014-03-11修回〕

(编辑李相军)