尾加压素Ⅱ对ox-LDL诱导的EVC-304细胞凋亡的影响

尾加压素Ⅱ对ox-LDL诱导的EVC-304细胞凋亡的影响

高宇钟秀宏1黄丽红2

(吉林大学中日联谊医院神经内二科，吉林长春130033)

摘要〔〕目的探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)对ox-LDL诱导的EVC-304细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制。 方法体外培养人脐静脉内皮细胞系ECV304，将不同浓度UⅡ及ox-LDL与内皮细胞共同孵育24 h后，应用倒置显微镜观察细胞形态变化，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测内皮细胞活性，TUNEL、流式细胞仪检测内皮细胞凋亡,免疫组化法检测内皮细胞凋亡基因bcl-2,bax,caspase-3 蛋白表达水平。结果ox-LDL(20 μg/ml)处理24 h后,可诱导内皮细胞凋亡；同时给予不同浓度的UⅡ(20 μg/ml ox-LDL+10-10 mol/L UⅡ，20 μg/ml ox-LDL+10-9 mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-8 mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-7 mol/L UⅡ)处理24 h后，可显著增强ox-LDL诱导内皮细胞凋亡作用，并呈浓度依赖性。ox-LDL处理内皮细胞24 h后，bcl-2 蛋白阳性表达率降低，而bax、caspase-3阳性表达率升高。同时给予UⅡ可增强促凋亡作用，与ox-LDL组比较，ox-LDL+UⅡ 组的bcl-2 蛋白阳性表达率显著降低(P<0.05)，而bax、caspase-3阳性表达率显著升高(P<0.05)。结论UⅡ可增强ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡,并呈浓度依赖性，其作用可能与bcl-2、bax、caspase-3调节有关。

关键词〔〕尾加压素;ox-LDL;内皮细胞;凋亡

中图分类号〔〕R592〔文献标识码〕A〔

基金项目：吉林省科技厅国际合作处

通讯作者：黄丽红(1968-)，女，副教授，博士，主要从事老年病的诊断及治疗研究。

1吉林医药学院病理教研室2吉林大学中日联谊医院老年病科

第一作者：高宇(1975-)，女，主治医师，博士，主要从事脑血管病的诊断及治疗研究。

血管内皮细胞(EVC)损伤或功能障碍在动脉粥样硬化(AS)发病中起重要作用〔1〕。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)具有很强的细胞毒性，可诱导内皮细胞凋亡，参与AS的发生发展〔2〕。近年研究表明,尾加压素Ⅱ(UⅡ)具有诱导大鼠血管平滑肌细胞及内皮细胞凋亡作用〔3〕。本研究旨在观察UⅡ对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响，并探讨bcl-2 、bax、caspase-3在诱导内皮细胞凋亡中的作用。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器大鼠UⅡ(美国Phoenix Pharmac ZNC)，乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco公司)，ox-LDL、噻唑蓝(Sigma公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM培养液、胎牛血清(杭州四季青生物公司);bcl-2、bax、caspase-3鼠抗人单克隆抗体;原位细胞凋亡检测试剂盒;二胺基联苯胺(DAB)显色液：北京中山生物技术有限公司产品;溴乙锭(EB)，美国Sigma公司产品 。 倒置显微镜、CO2养箱、 超净台、酶联免疫检测仪、DYY-Ⅲ8A电泳仪、 流式细胞仪。

1.2细胞分组及药物处理EVC-304细胞随机分为空白对照组，细胞对照组(20 μg/ml ox-LDL)，20 μg/ml ox-LDL+10-10mol/L UⅡ，20 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-8mol/L UⅡ组,20 μg/ml ox-LDL+10-7mol/L UⅡ组。培养24 h，观察细胞的变化。将对数生长期的细胞按所需浓度接种，待4 h后细胞完全贴壁，ox-LDL和UⅡ处理，培养至预定时间，收集各组细胞进行以下实验，每个实验至少重复3次。

1.3形态学观察各组细胞定时用倒置显微镜观察形态变化。

1.4四甲基偶氮唑蓝实验法(MTT 法)取状态良好的处于对数生长期的EVC-304，继续培养24 h，EDTA消化制成单细胞悬液，显微镜下计数细胞量，细胞按1×105/ml接种于96孔板，每孔200 μl，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，初步确定用药范围。 各组均设3个复孔，4 h贴壁后,除空白对照组外，其余各组加终浓度为20 μg/ml ox-LDL,然后除空白对照组和细胞对照组加20 μl生理盐水外，其余实验组加入不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)UⅡ 20 μl处理 ，培养24 h，药物终止前4 h加MTT,每孔加人新配制的MTT液(5 mg/ml)20 μl，置于孵育箱内培养4 h，吸去培养液，每孔加入 200 μl DMSO，用酶标仪于490 nm波长测吸光度值，实验重复3次。

1.5采用TUNEL法检测细胞凋亡细胞爬片标本制作如上述，4%多聚甲醛在常温下固定30 min,PBS洗2 min×2次，蒸馏水洗涤2 min×2次，试验操作按北京中山生物技术有限公司试剂说明书进行，并略加修正。

1.6流式细胞仪测定取对数生长期的EVC-304细胞,EDTA消化，制备成单细胞悬液，置于25 ml的培养瓶中培养，细胞对照组和实验组加入ox-LDL，使其终浓度为20 μg/ml，然后实验组各组加入UⅡ，使其终浓度分别为(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L)，孵育24 h，细胞对照组和空白对照组加入等体积的生理盐水，将培养瓶置入37℃、CO2培养箱中培养，24 h后收集细胞，PBS洗涤2次后离心，制备成细胞悬液；70%乙醇固定，4℃保存过夜，将单细胞悬液离心后，PBS洗涤2次后离心；细胞调整在1×106ml；加入RNaseA 37℃水浴30 min；再加EB染色液4℃避光30 min；上机行流式细胞仪测定，记录激发波长488 nm处红色荧光，检测凋亡率，分析细胞周期分布状况。

1.7免疫细胞化学染色检测 bcl-2、 bax、caspase-3蛋白表达取对数生长期细胞，收集各组细胞，制备细胞涂片，4%多聚甲醛固定后，空气中晾干，按试剂盒说明进行。免疫组化判定标准：bcl-2、bax、caspase-3阳性反应为棕黄色；bcl-2、bax定位于胞质，可见于胞膜和核膜；caspase-3定位于胞质。随机选取10个高倍镜视野(>1 000个细胞)，计数阳性细胞数和总细胞数。

2结果

2.1倒置显微镜下观察UⅡ对ox-LDL处理后EVC-304形态和生长的影响空白对照组细胞贴壁生长,呈铺路石状镶嵌排列；细胞为多角形、梭形或不规则形,边界清楚,胞质丰富；细胞核为圆形或椭圆形,核内染色质稀疏空亮,可见核仁。细胞传代培养时约30 min即开始贴壁生长，刚贴壁的细胞呈圆形,逐渐转变为多角形、梭形或不规则形,细胞间相互连接，见图1。

细胞对照组细胞体积变小，细胞变圆，细胞膜完整，染色质凝聚，细胞折光能力降低，贴壁能力明显减弱，吹打易离壁漂浮，生长受抑制(图2)；20 μg/ml ox-LDL+UⅡ10-7mmol/L组细胞体积变小、细胞变圆，细胞膜完整，染色质凝聚，细胞折光能力降低，贴壁能力明显减弱，吹打易离壁漂浮，随浓度升高生长受抑制明显，见图1。

图1　倒置显微镜观察各组EVC-304细胞形态(×100)

2.2MTT法测定UⅡ对ox-LDL处理后EVC304增殖的影响体外培养的EVC304细胞分别在培养液及20 μg/ml ox-LDL，20 μg/ml ox-LDL+10-10mol/L UⅡ，20 μg/ml ox-LDL+10-9mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-8mol/L UⅡ,20 μg/ml ox-LDL+10-7mol/L UⅡ分别培养24 h，其A 值分别为0.68±0.11,0.56±0.07，0.52±0.02，0.49±0.006，0.43±0.042，0.37±0.019，表明20 μg/ml ox-LDL 抑制人脐静脉内皮细胞增殖，UⅡ可增强ox-LDL抑制增殖作用，且呈浓度依赖性。

2.3TUNEL法检测细胞凋亡光镜下可见，经UⅡ处理24 h后，EVC-304细胞凋亡数明显增加，棕褐色染色颗粒定位于细胞核内，染色阳性的EVC-304出现核碎裂、核质固缩、细胞膜突出形成质膜小泡等凋亡细胞形态学变化；经10-10～10-6mol/L UⅡ处理24 h后，AI随UⅡ浓度的增加而增加，AI值分别为6.57±0.92,9.46±1.61,15.55±1.48,28.96±2.28；与空白对照组及细胞对照组(1.71±0.65,5.6±0.87)相比，差异均有显著性(P<0.01)，见图2。

图2　TUNEL法检测细胞凋亡(×100)

2.4流式细胞仪检测对EVC-304细胞周期的影响及凋亡率空白对照组EVC-304细胞的DNA在G0/G1期较高为64.30%，S期为20.9%，G2/M期为16.1%。细胞对照组EVC-304细胞在G0/G1期较高为72.4.%，S期为17.1%，G2/M期为10.5%；10-10～10-7mol/L的UⅡ作用EVC-304细胞24 h后，G0/G1期细胞百分比上升(73.6%，75.9%，88.6%，90.6%)，S期(16.1%、15.9%、5.2%、3.1%)和G2/M期(10.3%，8.2%，6.2%，5.3%)细胞百分比下降，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)。

未用药时，细胞培养24 h，凋亡细胞仅1.7%，未见亚二倍体峰(亚二倍体峰小于5%为自然凋亡峰)。经20 μg/ml ox-LDL作用24 h后和在20 μg/ml ox-LDL基础上又经10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L UⅡ处理24 h后，均可见凋亡峰，凋亡率分别为6.7%、11.57%、15.97%、21.22%,25.87%，与对照组相比有统计学差异(P<0.01)，实验各组与细胞对照组比较有统计学差异(P<0.01)。

2.6免疫细胞化学染色法检测bcl-2、bax、caspase-3蛋白如图3所示，20 μg/ml ox-LDL+10-7mol/L组bcl-2 蛋白阳性表达率为0.369±0.039，比细胞对照组(0.561±0.028)明显降低；bax蛋白阳性表达率为 0.557±0.035，比细胞对照组(0.405±0.038)明显增高，caspase-3蛋白阳性表达率为 0.769±0.03，比细胞对照组(0.643±0.029)明显增高(均P<0.01)。

图3　免疫细胞化学染色法检测bcl-2、bax、 caspase-3蛋白(×200)

3讨论

EVC细胞凋亡参与了AS的发生及发展过程，被认为是AS的始动环节〔4〕。研究表明，xo-LDL在血管内皮损伤中起关键作用，其作用机制涉及炎症、免疫等方面〔5～7〕。近年研究表明，UⅡ在EVC、平滑肌细胞、泡沫细胞、炎症细胞中表达，其表达的改变与AS的进程有关，推测UⅡ可能直接或间接参与AS发生及发展〔8,9〕。本实验结果证实ox-LDL 诱导EVC凋亡，同时UⅡ 可加强ox-LDL的促凋亡作用，且存在浓度依赖性。在细胞凋亡的过程中，caspases家族起着非常重要的作用，其中，Caspases-3是关键的信息分子，是凋亡机制的核心成分〔10〕。bcl-2家族蛋白可调节细胞凋亡，bcl-2是正常细胞的凋亡抑制基因,bax是促凋亡基因,bcl-2 下调及bax上调,抗凋亡能力下降,细胞凋亡增加。本实验结果再次表明，ox-LDL及UⅡ造成血管内皮细胞凋亡是通过线粒体细胞色素C介导的凋亡通路，启动caspase级联反应，导致细胞凋亡。 提示UⅡ可增强ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡,并呈浓度依赖性，其作用可能与 bcl-2、bax、caspase-3调节有关。

4参考文献

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〔2015-01-17修回〕

(编辑袁左鸣)