PPARγ、NFkB P65在溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜组织中的表达及意义

尹　剑　董　蕾

PPARγ、NFkB P65在溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜组织中的表达及意义

尹剑董蕾※

【摘要】目的探讨过氧化物酶增殖物激活受体(PPARγ)、核转录因子-kB p 65(NFkB p65)在溃疡性结肠炎(UC)小鼠肠黏膜组织中的表达及意义。方法20只健康雄性小鼠，随机分为模型组和对照组，各10只，模型组小鼠自由饮用5%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液，连续7天，对照组小鼠自由饮用生理盐水7天。造模成功后处死小鼠，取同水平段结肠组织，以免疫组化法观察两组小鼠黏膜形态学变化，进行疾病活动指数(DAI)评分及病理组织学分级，并检测PPARγ和NF-κB p65表达水平。结果模型组小鼠DAI评分为8.42±1.13分，对照组DAI评分为0.47±0.23分，组间差异显著(P<0.01)。PPARγ和NF-κB主要表达于上皮细胞的细胞核中，对照组可见大量PPARγ阳性细胞，NF-κB阳性细胞较少，模型组PPARγ阳性细胞较少，可见大量NF-κB阳性细胞。模型组小鼠病理分级越严重，PPARγ表达水平越低，NF-κB表达水平越高，两两比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论PPARγ和NFkB P65可能参与UC小鼠炎症的发生发展，联合检测其表达水平有助于判定病情严重性。

【关键词】过氧化物酶增殖物激活受体核转录因子-kB溃疡性结肠炎免疫组化

溃疡性结肠炎(UC)是发生于结肠黏膜的慢性非特异性炎症，呈反复发作特征，目前其确切病因尚不明缺，可能与遗传因素、免疫及肠道菌群等多因素相互作用有关[1]。过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)是由配体激活的一类核转录因子超家族成员, 包括α，β/δ和γ三种表型，其被配体激活后可调节细胞核内靶基因的转录[2]。研究表明，PPARγ在UC患者肠黏膜组织中表达低于正常对照人群[3，4]，且随着病理分级的增加，PPARγ的阳性表达率也逐步下降[5]。核转录因子-kB(NFkB)是调控UC炎症反应的重要因子，由p50、p52、p65等组成，其中NFkB p65在UC活动期患者肠黏膜组织中呈现高表达状态。本研究通过建立UC小鼠模型，观察肠黏膜组织中PPARγ和NF-κB p65的表达，探讨UC可能的发病机制，现报告如下。

1.材料与方法

1.1试验动物健康BALB/c小鼠20只，雄性，体质量18～20g，7～8周龄，由陕西省动物研究所提供。

1.2主要试剂葡聚糖硫酸钠(DSS)，购自美国MPBIO公司；鼠抗PPARγ和NF-κB p65单克隆抗体，均购自美国Santa Cruz公司；免疫组化试剂及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3分组与造模20只小鼠随机分为模型组和对照组，各10只，清洁级试验室常规饲养。模型组小鼠自由饮用5%DSS溶液(DSS溶于三蒸水中配制而成)，连续7天，对照组小鼠自由饮用生理盐水7天。自造模第1天起，每日观察小鼠的活动、体质量变化及大便情况。以小鼠出现腹泻、大便稀、隐血阳性或肉眼血便等症状为造模成功。

1.4结肠组织形态学观察造模7天后，处死所有小鼠，取同水平段结肠组织，肉眼观察其形态变化。病变部位留取一1.0×1.0×0.2cm标本，多聚甲醛固定24小时后，石蜡包埋，连续切片，在光学显微镜下观察组织形态学变化，由2名专业病理医师进行双盲判定，并进行疾病活动指数(DAI)评分及病理组织学分级。DAI评分采用Sutherland标准，包括腹泻频率、直肠出血、黏膜表现和医师评估病情4个方面，每项得分为0～3分[6]。病理组织学分级：据黏膜固有层炎细胞浸润及隐窝炎症情况，分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级[7]。

1.5PPARγ和NF-κB p65表达测定采用免疫组化法检测PPARγ和NF-κB p65表达水平，镜下观察染色情况。PPARγ和NF-κB p65均以细胞质或细胞核出血棕黄色颗粒为阳性细胞，任意取5个高倍视野，以图像分析系统测定表达水平。

2.结果

2.1两组小鼠一般情况模型组在造模第2天有3只小鼠毛发无光泽，进食量和体质量下降；第3天，4只小鼠出现稀便，大便隐血阳性，随后各小鼠均出现不同程度症状；至造模第7天，均出现明显毛发脱落、精神萎靡、腹泻、便血症状等，表明造模成功。对照组小鼠体质量、饮食、大便、毛发及活动等基本正常，无死亡。

2.2两组肠黏膜形态学及DAI评分比较模型组小鼠肠黏膜可见多发性溃疡，大小、深浅不一，腺体结构不清，排列紊乱，大量炎细胞(中性粒细胞为主)浸润，黏膜下水肿，有淋巴滤泡。对照组小鼠黏膜完整、光滑、腺体清晰，无炎细胞浸润及溃疡。模型组小鼠DAI评分为8.42±1.13分，对照组DAI评分为0.47±0.23分，组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3两组小鼠PPARγ和NF-κB p65表达及其与病理分级的关系PPARγ主要表达于上皮细胞的细胞核中，对照组可见大量阳性细胞，模型组阳性细胞较少；NF-κB在细胞质及细胞核均有表达，细胞核更为显著，对照组NF-κB阳性细胞较少，模型组N可见大量NF-κB阳性细胞。根据病理分级标准，模型组小鼠Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级分别为2只、3只、5只。经统计分析，病理分级越严重，PPARγ表达水平越低，NF-κB表达水平越高，两两比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1　不同病理分级小鼠PPARγ和NF-κB p65表达

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Ⅲ级比较，#P<0.05，##P<0.01；与Ⅱ级比较，△P<0.05，△△P<0.01。

3.讨论

UC的发病机制目前尚无定论，目前认为免疫反应异常可能是其重要环节，多种炎性介质和细胞因子相互作用，形成复杂的细胞因子网络，促进结肠黏膜发生炎症损伤。PPARγ具有抑制中性粒细胞、单核细胞和细胞因子聚集的作用，其表达受损会促进组织炎症损伤。结肠上皮是PPARγ的主要表达组织，其表达量仅次于脂肪组织。柯希权等[7]研究发现，PPARγ在UC模型大鼠结肠上皮中的阳性表达率为35%，而在正常大鼠中阳性表达率达80%，提示UC模型大鼠结肠组织中PPARγ表达明显受损。NF-κB是一种重要的炎症调控因子，试验研究[8，9]表明，NF-κB在模型组小鼠肠黏膜中的表达水平显著高于正常小鼠，可作为治疗UC的靶点。临床研究也表明，在UC活动期患者的肠黏膜组织中，其表达水平显著升高，且与病理分级呈正相关[10]。此外，有研究表明，PPARγ与NF-κB p65之间可能存在信号通路，PPARγ配体在激活PPARγ的同时抑制NF-κB的活性，从而抑制细胞因子的表达，缓解炎症损伤[11]。

本研究结果表明，PPARγ主要表达于对照组上皮细胞的细胞核中，模型组阳性细胞较少，NF-κB主要表达于模型组细胞质及细胞核中，对照组阳性细胞较少，且病理分级越严重，PPARγ表达水平越低，NF-κB表达水平越高，与上述报道基本一致，提示PPARγ和NFkB P65可能参与UC小鼠炎症的发生发展，联合检测这2项指标有助于判定UC的病情，并为治疗提供可能的靶点。

参考文献

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10石永强, 赵向阳, 王辉.溃疡性结肠炎肠黏膜中Act1、IL-17、NF-kB p65的表达及意义[J].东南大学学报(医学版), 2013, 32(5): 599-602.

11苗新普, 欧阳钦, 韦红, 等.溃疡性结肠炎组织中5-LOX、PPARγ和NF-κB p65的表达及意义[J].实用医学杂志, 2011, 27(10): 1757-1759.

作者单位：西安交通大学第二附属医院消化内科710004

基金项目：中国高校医学期刊临床专项资金(11521594)

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2015.04.016

收稿日期：2015-5-10

Expression and significance of PPARγ and NFkB p65 in intestinal mucosal tissues of mice with ulcerative colitis(YINJian,DONGLei.Departmentofgastroenterology,ThesecondaffiliatedhospitalofXi’anJiaotonguniversity,Xi’an710004,China.)

【Abstract】ObjectivesTo explore the expression and significance of peroxisome proliferators activated receptor (PPARγ) and nuclear factor kappa-kB p 65 (NFkB p65) in the intestinal mucosal tissues of mice with ulcerative colitis (UC). MethodsA total of 20 healthy mice were randomly divided into model group and control group, 10 for each group.Model group was given 5% dextra sulfate sodium (DSS) freely for continuously 7days, whereas control group with normal saline for 7days.After model establishment, the mice were sacrificed to obtain the colonic tissues of the same segment.Immunohistochemistry was used to observe the morphological changes of mucous membrane of mice in both groups, evaluate disease activity index (DAI) score and histopathological grades, and detect the expression of PPARγ and NF-κB p65. ResultsDAI scores were 8.42±1.13 points and 0.47±0.23 points in model group and control group respectively, and there was significant difference (P<0.01).PPARγ and NF-κB mainly expressed in the nucleus of epithelial cells.Control group showed abundant PPARγ positive cells but less NF-κB positive cells, whereas model group showed less PPARγ positive cells but abundant NF-κB positive cells.In model group, the severer the pathological grade, the lower the PPARγ expression level and the higher the NF-κB expression levels, which had significant differences when compared with control group (P<0.01).ConclusionsPPARγ and NFkB P65 may participate in the development and progression of the inflammation in UC mice, and their combined detection can help diagnose the disease severity.

【Key words】peroxisome proliferators activated receptor, nuclear factor kappa-kB, ulcerative colitis, immunohistochemistry

※为通讯作者